吳 俠, 成 鋼, 黎 歡, 李海霞, 湯志宏

(1. 南部戰(zhàn)區(qū)空軍參謀部門(mén)診部婦兒科, 廣州 510071;2. 湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院動(dòng)物健康養(yǎng)殖研究所, 常德 415000)

隨著東方田鼠(Microtus fortis)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化、標(biāo)準(zhǔn)化及規(guī)范化進(jìn)程的穩(wěn)步推進(jìn)，作為目前重要的天然抗日本血吸蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物，東方田鼠越來(lái)越受到廣大科研工作者的關(guān)注[1,2]。大量研究[3,4]證明，東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)作用是其體內(nèi)諸多組織與細(xì)胞參與漸進(jìn)性過(guò)程，是通過(guò)細(xì)胞機(jī)械性防御和分泌細(xì)胞因子及其它活性成分，以多種途徑參與其抗蟲(chóng)免疫和防御 。正常小鼠寄生蟲(chóng)感染后可引起大量游離單核細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集與活化，產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子和活性物質(zhì)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)、參與炎癥反應(yīng)及創(chuàng)傷愈合等過(guò)程[5]。前期試驗(yàn)已證明東方田鼠不同組織成纖維細(xì)胞傳代次數(shù)是相同的[6-9]，為了充分利用不同組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中活性成分，本試驗(yàn)分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第三代東方田鼠胚胎和皮膚成纖維細(xì)胞，第二代腹腔成纖維細(xì)胞，以及第一代肺臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共培養(yǎng)，對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征比較觀察，為進(jìn)一步從細(xì)胞、分子水平深入了解東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)機(jī)制，加快和拓寬探尋東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)活性分子提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源

野生東方田鼠5對(duì)捕自衡陽(yáng)市衡東縣新塘鎮(zhèn)楊塘河壩，經(jīng)鑒定均為長(zhǎng)江亞種(Mf. calamorum)，隨機(jī)分組，1對(duì)/籠，常規(guī)方法飼養(yǎng)于湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)條件與飼料同昆明小鼠[SCXK(湘)2016-0002]。雌雄合籠后，計(jì)算妊娠天數(shù)，根據(jù)試驗(yàn)需要取不同日齡東方田鼠作為試驗(yàn)用鼠。普通級(jí)雄性新西蘭白兔(1.5～2.0 kg)由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供[SCXK(湘)2017-0002]。 日本血吸蟲(chóng)陽(yáng)性釘螺購(gòu)自湖南省血吸蟲(chóng)病防治所。

1.2 主要試劑

DMEM(高糖)培養(yǎng)基(美國(guó) Invitrogen 公司)，新生牛血清(NBS杭州四季青生物工程有限公司)，胰蛋白酶(上海生工生物工程股份有限公司); 無(wú)鈣鎂PBS溶液由實(shí)驗(yàn)室配制消毒，其余常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。東方田鼠血清制備采用摘眼球取血法，兔血清制備采用心臟采血法，分別將采集的兩種血液放入離心管內(nèi)，37℃條件下放置15 min，待自然析出血清后，1 000 r/min 離心10 min，吸取上清，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 野生東方田鼠胚胎、皮膚、肺臟及腹腔成纖維細(xì)胞原代與傳代培養(yǎng) 根據(jù)文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道，取妊娠12 d的東方田鼠胎鼠和出生后1 ～3 d 東方田鼠乳鼠皮膚和肺臟組織分別運(yùn)用胰蛋白酶消化法和組織塊貼壁法進(jìn)行成纖維細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)。用無(wú)菌PBS灌洗成年野生東方田鼠腹腔，離心洗滌細(xì)胞沉淀進(jìn)行腹腔成纖維細(xì)胞分離與培養(yǎng)[9]。以含150 mL/L新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)上述4種細(xì)胞, 當(dāng)原代細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶的70%～80%時(shí), 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化傳代。原代和傳代細(xì)胞均置于37 ℃, 體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng), 定期觀察、記錄4種細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài), 根據(jù)試驗(yàn)需要定期收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)上清。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液的收集與處理 當(dāng)成纖維細(xì)胞處于快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期時(shí)，即胚胎、皮膚成纖維細(xì)胞第三代，腹腔成纖維細(xì)胞第二代，肺臟成纖維細(xì)胞第1代，小心收集上述細(xì)胞培養(yǎng)上清后，2 000 r/min 離心 10 min 取上清, -70 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)培養(yǎng) 用消毒生理鹽水將陽(yáng)性釘螺 20只沖洗2次，放入三角瓶，在 25 ℃有光照條件下，常規(guī)方法逸出尾蚴，用接種環(huán)定時(shí)多次收集上層尾蚴后，用無(wú)菌PBS 1 000 r/min 離心洗滌尾蚴2次，將尾蚴放入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用含體積分?jǐn)?shù) 25%新鮮兔血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)血吸蟲(chóng)尾蚴，于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，調(diào)整尾蚴密度，待其體外自然轉(zhuǎn)化為血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)[8]。

1.3.4 東方田鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清殺傷血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)試驗(yàn) 當(dāng)日本血吸蟲(chóng)尾蚴體外自然轉(zhuǎn)化為童蟲(chóng)后,吸除每孔童蟲(chóng)中全部培養(yǎng)基，將收集的4種細(xì)胞培養(yǎng)上清液于37 ℃解凍，將上清液轉(zhuǎn)移到含尾蚴的48孔培養(yǎng)板中, 調(diào)整尾蚴100±10 尾/孔, 每個(gè)樣本設(shè)立平行 3孔, 以不加其它物質(zhì)的DMEM 培養(yǎng)基為空白對(duì)照, 以含20 % 濃度的東方田鼠血清為陽(yáng)性對(duì)照, 于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng), 96 h內(nèi)定時(shí)觀察東方田鼠4種成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清體外殺傷日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)的效果, 統(tǒng)計(jì)童蟲(chóng)死亡率[8]。

1.3.5 童蟲(chóng)死活鑒定標(biāo)準(zhǔn) 活童蟲(chóng)一般培養(yǎng)24 h后分叉的尾巴脫落，蟲(chóng)體透明，自由蠕動(dòng)伸縮，內(nèi)部器官清晰可辨，美蘭染色易著色; 死亡童蟲(chóng)蟲(chóng)體模糊，表膜破損斷裂、內(nèi)容物外泄、鏡下觀察無(wú)立體感，美蘭染色一般不著色; 不易辨別死活的童蟲(chóng)以連續(xù)鏡下觀察 30 s不活動(dòng)判定為死童蟲(chóng)[2,3]。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

童蟲(chóng)死亡率數(shù)據(jù)用表示，統(tǒng)計(jì)分析由SPSS11.5軟件中One-way ANOVA分析完成,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清與血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共培養(yǎng)

試驗(yàn)96 h 內(nèi)連續(xù)觀察了野生東方田鼠4種成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清與血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共培養(yǎng)結(jié)果。培養(yǎng)結(jié)果表明, 與空白對(duì)照組和胚胎、皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清童蟲(chóng)相比, 東方田鼠腹腔與肺臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中童蟲(chóng)死亡率明顯增高, 童蟲(chóng)大多在72 h之內(nèi)呈現(xiàn)死亡特征, 表現(xiàn)為表膜皺縮，縊痕明顯; 培養(yǎng)96 h后, 蟲(chóng)體內(nèi)容物模糊并溢出，蟲(chóng)體周圍體壁上常沾附較多泡狀物，與添加20%東方田鼠血清的陽(yáng)性對(duì)照組死亡童蟲(chóng)狀態(tài)略有不同(圖1A～F)。

3.2 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中的童蟲(chóng)死亡率

取野生東方田鼠4種成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上液與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共培養(yǎng)96 h后，東方田鼠皮膚、胚胎、腹腔和肺臟組織的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中童蟲(chóng)死亡率，與空白對(duì)照和相比，腹腔和肺臟成纖維細(xì)胞對(duì)日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)有一定的殺傷效果(P=0.017;P=0.039)，詳見(jiàn)表1。

圖1 野生東方田鼠4種成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清96 h后體外殺傷日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)效果 (×100)Figure 1 Killing effect of 4 kinds of fibroblasts culture supernatant on schistosomula (×100)

3 討論

東方田鼠是目前已知鼠類中抗日本血吸蟲(chóng)能力最強(qiáng)的嚙齒類哺乳動(dòng)物[10,11]。賀宏斌等[12]早期研究表明，野生較室內(nèi)繁殖東方田鼠在日本血吸蟲(chóng)感染后肝臟表面結(jié)節(jié)大、數(shù)量多，消退快，說(shuō)明野生東方田鼠對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染應(yīng)激和免疫反應(yīng)更大。本課題組前期研究中曾經(jīng)以室內(nèi)繁殖東方田鼠細(xì)胞培養(yǎng)上清液與血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共培養(yǎng)96 h，并未觀察到明顯的童蟲(chóng)殺傷作用，可能與添加培養(yǎng)上清液濃度較小有關(guān)。為了進(jìn)一步明確野生東方田鼠細(xì)胞培養(yǎng)上清中是否存在抗日本血吸蟲(chóng)分子，以及加快和拓寬探尋東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)活性分子的進(jìn)程與渠道，試驗(yàn)收集了處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以100%添加量，96 h內(nèi)連續(xù)觀察了對(duì)血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)體外殺傷效果。培養(yǎng)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，腹腔和肺臟成纖維細(xì)胞對(duì)日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)有一定的殺傷作用，而且童蟲(chóng)死亡狀態(tài)與陽(yáng)性對(duì)照組童蟲(chóng)明顯不同。成纖維細(xì)胞可以向培養(yǎng)液中分泌細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白血病抑制因子等種類繁多的蛋白成分，具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)損傷組織修復(fù)等功能，童蟲(chóng)死亡狀態(tài)和殺傷效果的不同，是否表明在野生東方田鼠腹腔和肺臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在能引起血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)死亡的抗蟲(chóng)活性分子。為了闡明上述推論，課題組已展開(kāi)對(duì)野生東方田鼠腹腔和肺臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗性分子的分離和篩選工作，希望對(duì)東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)感染機(jī)制相關(guān)研究提供新的線索。

表 1 野生東方田鼠4種成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上液與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共培養(yǎng)96 h后結(jié)果Table 1 Killing effect of 4 kinds of fibroblasts culture supernatant on schistosomula