喬自林，馬 祺，王家敏 ，馮若飛，李明生 ，令世鑫，馬忠仁

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010；3. 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030)

BHK21細(xì)胞，即敘利亞倉鼠腎細(xì)胞.該細(xì)胞系于1961年由Macpherson IA、Stoker MGP建系，源自5只未辨性別的1天齡倉鼠腎.該細(xì)胞是目前我國口蹄疫疫苗生產(chǎn)的惟一細(xì)胞系，原始的BHK21細(xì)胞株為貼壁生長[1，2].為提升口蹄疫疫苗的技術(shù)水平和產(chǎn)品質(zhì)量，業(yè)內(nèi)從細(xì)胞馴化、個(gè)性化培養(yǎng)基開發(fā)和生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝等方面進(jìn)行了深入研究.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心與口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)合作開展了口蹄疫疫苗全懸浮培養(yǎng)工藝研究，得到了無血清全懸浮培養(yǎng)型細(xì)胞，并對口蹄疫病毒敏感.現(xiàn)將細(xì)胞馴化過程和馴化后細(xì)胞的質(zhì)量評價(jià)情況進(jìn)行交流.

1 材料與方法

1.1 材料

BHK21細(xì)胞(ATCC引進(jìn)，編號：CCL-10,代次：P53)，MEM、DMEM/F12和 Anti-Clumping Agent(Invitrigen)，BFPM-BHK21無血清培養(yǎng)基(蘭州百靈)，新生牛血清(NBCS，蘭州民海)，PF-68、Hoechst33258熒光染色液(Sigma)，無菌與支原體培養(yǎng)法檢查培養(yǎng)基(北京三藥)，病毒檢查陽性對照(中監(jiān)所)、病毒熒光抗體結(jié)合物(VMRD)和細(xì)胞(本室保存)；SPF級種蛋(斯帕法斯)，SPF級BALB/c Nude 裸鼠(維通利華)，SPF級BALB/c乳鼠和成鼠(甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)等.

2 方法

2.1 BHK21細(xì)胞的復(fù)蘇和檢定

用含10%NBCS的MEM復(fù)蘇引進(jìn)的BHK21細(xì)胞，待生長至致密單層后傳代，按1∶6分瓶比例連續(xù)傳代培養(yǎng)兩代后凍存?zhèn)溆?

2.1.1 細(xì)胞鑒別

復(fù)蘇后用倒置顯微鏡直接觀察，形態(tài)與ATCC的形態(tài)圖對比；用常規(guī)方法制備染色體標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)50個(gè)處于中期分裂相的細(xì)胞染色體數(shù)目.

2.1.2 生長特性

按文獻(xiàn)方法[3].

2.1.3 無菌和支原體檢查

按文獻(xiàn)方法檢查[4].

2.2 懸浮培養(yǎng)馴化

2.2.1 低血清適應(yīng)培養(yǎng)

復(fù)蘇P56代凍存的細(xì)胞，用10%NBCS的MEM培養(yǎng)2代血清降至8%.再逐步用DMEM/F12替代MEM并降低血清濃度.血清降到3%時(shí)在培養(yǎng)液中加5%～10%條件培養(yǎng)基，傳代分瓶比例以48 h生長成致密單層為宜.

2.2.2 低血清懸浮馴化

適應(yīng)3%NBCS低血清培養(yǎng)的P77代以后細(xì)胞，逐步用無血清培養(yǎng)基替代DMEM/F12，降低分瓶比例.收集懸浮在培養(yǎng)液中細(xì)胞和貼附性不好的細(xì)胞，也可用胰酶輕度消化后收集剩余細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為(3～5)×105/mL.在培養(yǎng)液中補(bǔ)加0.03%PF-68和0.02%的Anti-Clumping Agent置110 r/min搖床，培養(yǎng)48 h離心置換一半培養(yǎng)液.

2.2.3 無血清培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)

待細(xì)胞密度達(dá)2×106/mL以上離心后換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，每72 h傳代一次.傳代接種密度為5×105/mL，至細(xì)胞形態(tài)和生長規(guī)律趨于穩(wěn)定后凍存.凍存密度為(1.0～1.5)×107/mL，凍存液中加20%NBCS和10%DMSO.

2.3 懸浮細(xì)胞的檢定

2.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇和活力檢查

在無血清培養(yǎng)基中加20%NBCS復(fù)蘇凍存的懸浮細(xì)胞，第二代加5%NBCS，以后直接用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng).用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢查復(fù)蘇細(xì)胞活力.

2.3.2 染色體核型

染色體核型同2.1.1.

2.3.3 生長和代謝特性

連續(xù)檢測細(xì)胞以3×105/mL接種，在110 r/min搖床批培養(yǎng)每24 h的活力、密度以及培養(yǎng)液中葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的量，繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算代謝速率[5].

2.3.4 無菌、支原體、病毒和致瘤性檢查

無菌、支原體、病毒和致瘤性檢查依據(jù)文獻(xiàn)[4].

2.4 生物反應(yīng)器培養(yǎng)

2.4.1 批培養(yǎng)

細(xì)胞以5.0×105/mL密度接種到5 L反應(yīng)器中，培養(yǎng)液體積5 L，反應(yīng)器參數(shù)：溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min、溶氧50%、pH 7.20.

2.4.2 流加培養(yǎng)

初始培養(yǎng)體積2 L和密度1.0×106/mL接種，按2.4.1的方法培養(yǎng)，細(xì)胞密度(2.5～3)×106/mL時(shí)補(bǔ)培養(yǎng)基1.5 L，再培養(yǎng)至細(xì)胞密度(3.5～4)×106/mL時(shí)再補(bǔ)液1.5 L.

3 結(jié)果

1) 從ATCC引進(jìn)的BHK21細(xì)胞形態(tài)呈長梭形和不規(guī)則形，與ATCC公布的細(xì)胞圖片一致[6]，染色體眾數(shù)為42±2為66%，生長曲線呈“S”型曲線，最大增殖濃度達(dá)5.03×105/mL，倍增時(shí)間為17.99 h.無菌和支原體檢查為陰性.

2) 運(yùn)用逐步改變培養(yǎng)基和降低血清濃度的方法馴化，BHK21細(xì)胞能適應(yīng)低血清培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)從最初的長梭形變成短梭形或近圓形，生長速度也減緩分瓶比例降至1∶4，48 h才能長成致密單層.懸浮培養(yǎng)的前期細(xì)胞有嚴(yán)重的結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，在錐形瓶瓶壁上有肉眼可見的貼壁生長細(xì)胞層，在無血清培養(yǎng)基中傳代10次后細(xì)胞生長變快，形態(tài)趨于較均一的圓形，見圖1.

3) 馴化的懸浮培養(yǎng)型BHK21細(xì)胞復(fù)蘇活力達(dá)92%以上，細(xì)胞呈較均一的圓形.染色體眾數(shù)為42±2為54%，核型為12M+19SM+11T，與馴化前的貼壁細(xì)胞一致.生長曲線呈“S”型，最大增殖濃度為6.64×106/mL，倍增時(shí)間為17.73 h.在對數(shù)生長期葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨的比代謝率為-0.27 mg/106cells·24h、0.34 mg/106cells·24h、-0.54 umol/106cells·24h、-0.04 umol/106cells·24h和0.55umol/106cells·24h.無菌和支原體檢查為陰性.細(xì)胞凍融的上清液接種Vero、BHK21和MRC-5細(xì)胞，沒有細(xì)胞病變和雞紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象.接種雞胚后，雞胚存活100%(10/10)，尿囊液血凝試驗(yàn)為陰性；接種乳鼠和成鼠后，動(dòng)物100%存活(20/20)，且沒有出現(xiàn)異常反應(yīng)；用熒光抗體結(jié)合物檢查BVDV、BAV-3、BPV、PI-3、REO和PPV均未呈現(xiàn)特異性熒光，表明細(xì)胞未受外源病毒污染.裸鼠成瘤率100%(10/10)且呈進(jìn)行性生長.

4) 馴化的BHK21細(xì)胞在5 L生物反應(yīng)器中進(jìn)行批培養(yǎng)和流加培養(yǎng)，密度可達(dá)5.71×106/mL和6.63×106/mL，見表1.在650 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)口蹄疫病毒，90%以上細(xì)胞病變時(shí)間為13 h～18 h，146 s在2.45μg/mL ～4 μg/mL.

表1 5 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)BHK21懸浮細(xì)胞的結(jié)果

圖1 BHK21細(xì)胞(A.ATCC；B.引進(jìn)后復(fù)蘇；C.懸浮馴化前期；D.完全懸浮培養(yǎng))

4 討論

生物反應(yīng)器無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)運(yùn)用于疫苗生產(chǎn),不僅會(huì)節(jié)省大量場地和人力，還可減化純化工藝，降低動(dòng)物注射后的副反應(yīng)，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量，是疫苗行業(yè)追求的目標(biāo).馴化得到無血清全懸浮高密度培養(yǎng)的細(xì)胞是工藝關(guān)鍵.逐步降低血清濃度適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的馴化方法，不改變細(xì)胞的遺傳特性，是得到病毒高效表達(dá)細(xì)胞株的最有效方法之一.BHK21貼壁培養(yǎng)時(shí)對培養(yǎng)基的要求較低，在5%～10%NBCS時(shí)MEM能滿足需要，血清加量減少時(shí)需要用營養(yǎng)更豐富的DMEM/F12.培養(yǎng)過細(xì)胞的培養(yǎng)液即條件培養(yǎng)基中有細(xì)胞的分泌物，這些分泌物對細(xì)胞度過凍存、復(fù)蘇前期、低血清等“苛刻”條件有保護(hù)作用[7-8].懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基中一般都含有抗剪切力和促分散的成分.在懸浮馴化前期培養(yǎng)液還沒有完全用無血清培養(yǎng)基時(shí)需要添加PF-68和Anti-Clum-ping Agent等，可提高細(xì)胞的存活率.馴化的細(xì)胞用含20%NBCS復(fù)蘇的活力與不含血清的基本一致，但是含血清復(fù)蘇后前兩代生長明顯快，此后無血清復(fù)蘇的也沒有差別.在相同的細(xì)胞量接種時(shí)流加培養(yǎng)的細(xì)胞利用培養(yǎng)基效率高、生長快.

細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)的基質(zhì)，其質(zhì)量直接影響疫苗的質(zhì)量和安全性.一株細(xì)胞用于生產(chǎn)前必須進(jìn)行全面的生物學(xué)研究和質(zhì)量評價(jià)[9].評價(jià)內(nèi)容包括歷史來源、培養(yǎng)及馴化過程、細(xì)胞鑒別、復(fù)蘇后活力、生長特征、微生物污染和內(nèi)外源病毒因子檢查，用于人用疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞株還要進(jìn)行活細(xì)胞的致瘤性和致癌性檢查，有的還要進(jìn)行均一性及傳代穩(wěn)定性檢查.

本研究馴化的全懸浮培養(yǎng)型BHK21細(xì)胞的來源歷史清楚，有較高的復(fù)蘇活力，細(xì)胞沒有被細(xì)菌、真菌和支原體等微生物污染.通過內(nèi)、外源病毒因子檢查，排除了致細(xì)胞病變的病毒、致紅細(xì)胞吸附的病毒和致雞胚、乳鼠和成鼠異常反應(yīng)的病毒以及傳代過程中使用胰蛋白酶、牛血清可能造成的病毒污染.馴化的細(xì)胞適用生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)，對口蹄疫病毒敏感，能用于口蹄疫疫苗研究和生產(chǎn).由于BHK21細(xì)胞本身具有很強(qiáng)的致瘤性，馴化后仍具有致瘤性，用于人用生物制品的生產(chǎn)還需要進(jìn)行細(xì)胞碎片和DNA的致癌性研究.