解玉懷，王麗雪，楊維仁，張桂國，張崇玉，劉艷花，張濟(jì)福

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東省動物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018； 2.膠州市畜牧獸醫(yī)局，山東 青島 266300)

腸道不僅是機(jī)體的食物消化和營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，也是機(jī)體表面積最大的免疫器官。腸道特異性免疫及粘膜屏障組成了腸道免疫系統(tǒng)，是機(jī)體第一道免疫防線的重要組成部分[1]，也是病原微生物侵入機(jī)體最主要的位置。機(jī)體許多疾病的發(fā)生都是從腸道免疫屏障的破壞開始的，通過營養(yǎng)調(diào)控維持畜禽腸道免疫處于最佳水平是保證腸道健康、減少疾病和降低經(jīng)濟(jì)損失的重要手段。

腸道特異性免疫系統(tǒng)是由散布在腸粘膜上皮和固有層內(nèi)的免疫細(xì)胞、免疫因子以及腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node，MLN)、Peyer結(jié)(Peyer’s patch,PP)等組織構(gòu)成[2]；非特異性的腸道粘膜屏障則包括腸道上皮細(xì)胞間的物理屏障，粘膜化學(xué)屏障以及微生物屏障[3]，二者共同構(gòu)成了機(jī)體腸道免疫系統(tǒng)，保護(hù)著機(jī)體免受病原體的侵害。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物提取物包括植物多糖、生物堿、植物多酚、黃酮、皂甙以及植物精油在內(nèi)的多種成分，是具有重要生物功能的天然活性物質(zhì)，不僅在畜禽生產(chǎn)性能改善、養(yǎng)分消化率提升方面有著顯著作用，而且作為抗生素替代品，在機(jī)體免疫力提高、抗氧化、抗病毒等方面也發(fā)揮著多種藥理功效[4]，其開發(fā)利用對畜牧生產(chǎn)具有重要的意義。

1 腸道免疫系統(tǒng)概述

腸道免疫系統(tǒng)是由大量彌散分布在腸粘膜上皮和固有層內(nèi)的免疫細(xì)胞、免疫因子、PP結(jié)等腸道相關(guān)性淋巴組織(gut-associated lymphatic tissue,GALT)以及非特異性粘膜屏障構(gòu)成，它是組成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要部分，也是機(jī)體最大的淋巴器官，在維持機(jī)體腸道健康，抵抗病原入侵中起到重要作用。

1.1 腸道免疫系統(tǒng)的構(gòu)成

腸道上皮免疫系統(tǒng)按照功能分為免疫誘導(dǎo)部位和效應(yīng)部位。誘導(dǎo)部位主要為PP結(jié)，效應(yīng)部位主要包括腸粘膜上皮內(nèi)和固有層的淋巴細(xì)胞(圖1)[2]。小腸PP結(jié)是小腸內(nèi)淋巴濾泡的集合體，為高度器官化黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosal-associated lymphoid tissue,MALT),主要由T、B淋巴細(xì)胞(CD4+)組成；濾泡表面覆蓋一層濾泡相關(guān)上皮(follicle-associated epithelial cells，F(xiàn)AE),主要由腸道上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和特定的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞(微褶皺細(xì)胞，又稱M細(xì)胞)構(gòu)成，腸道上皮細(xì)胞與粘膜層構(gòu)成了粘膜屏障。在PP結(jié)的淋巴濾泡中含有大量免疫細(xì)胞，受抗原刺激形成效應(yīng)中心，B淋巴細(xì)胞及增殖淋巴母細(xì)胞主要聚集于此，并多數(shù)為IgA+細(xì)胞，濾泡間區(qū)含有少量IgM+和IgD+細(xì)胞。T、B淋巴細(xì)胞在此分化成熟，并移行到粘膜的相應(yīng)位置發(fā)揮其免疫效應(yīng)。

圖1 腸道免疫系統(tǒng)Fig. 1 Intestinal immune system

該圖基于文獻(xiàn)[2-3]制作。

Fig. 1 was made referred to reference [2-3].

1.2 腸道特異性免疫

腸道特異性免疫分為體液免疫和細(xì)胞免疫。完整的免疫系統(tǒng)對細(xì)菌、病原體及有害抗原做出免疫排斥與清除工作。這其中參與免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞包括效應(yīng)T細(xì)胞、效應(yīng)B細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)，主要的輔助細(xì)胞主要有M細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)和巨噬細(xì)胞。

1.2.1體液免疫 體液免疫是腸道免疫的主要過程，即產(chǎn)生SIgA。此過程中，M細(xì)胞擔(dān)任著免疫的門戶，進(jìn)入腸道的細(xì)菌、病毒等抗原首先被M細(xì)胞捕獲，并轉(zhuǎn)移給淋巴濾泡中集結(jié)的巨噬細(xì)胞。未清除的抗原被提交到上皮淋巴組織處，并激活淋巴組織內(nèi)的T、B細(xì)胞，被激活的T、B細(xì)胞通過淋巴導(dǎo)管系統(tǒng)游離與粘膜結(jié)合的淋巴組織，通過胸導(dǎo)管進(jìn)入血液循環(huán)，最后到達(dá)腸道固有層與相關(guān)腺體處。同時DC也能夠到達(dá)上皮細(xì)胞處，具有較強(qiáng)的抗原捕獲能力。腸道固有層是粘膜免疫的主要效應(yīng)部位，B細(xì)胞定居于固有層，在抗原、細(xì)胞因子及輔助性T細(xì)胞(Th)的刺激下增殖分化為成熟的IgA漿細(xì)胞。漿細(xì)胞分泌的IgA通過J鏈鏈接的二聚體與分泌成分(SC)結(jié)合構(gòu)成SIgA，分泌到粘膜表面，發(fā)揮著阻止病原體黏附或進(jìn)入粘膜上皮、溶解細(xì)菌以及中和病毒等作用[5]。

1.2.2細(xì)胞免疫 粘膜固有層細(xì)胞包括上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)、T細(xì)胞、K細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK等在內(nèi)的固有層免疫細(xì)胞構(gòu)成了腸道細(xì)胞免疫。IEL中90%是CD3+T細(xì)胞，其中CD4+T細(xì)胞包括誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)和Th細(xì)胞，主要起輔助與誘導(dǎo)的作用，占CD3+細(xì)胞的65%～80%。CD8+細(xì)胞，包括抑制性T細(xì)胞(Ts)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc),其通過直接殺傷作用負(fù)責(zé)對靶細(xì)胞的清除，主要起著抑制和毒殺的作用。腸道粘膜中CD4+T細(xì)胞可促進(jìn)IgA的合成，CD8+細(xì)胞起到抑制作用。同時T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-4、IL-13等對粘膜化學(xué)屏障，特別是黏液與黏蛋白的分泌起到促進(jìn)作用[6]。

1.3 非特異性腸道粘膜免疫屏障

非特異性腸道粘膜免疫屏障是腸道免疫的天然屏障，主要包括腸道物理屏障、化學(xué)屏障和微生物屏障(圖2)[3]。各個屏障通過不同的分子機(jī)制、信號通路及生物學(xué)功能，發(fā)揮著抵抗外來抗原與病原菌的黏附與入侵，對機(jī)體起到初步的免疫防御作用。

圖2 腸道粘膜非特異性免疫屏障Fig. 2 Nonspecific immune barrier of gut mucosa

該圖基于文獻(xiàn)[3]制作。

Fig. 2 was made referred to reference [3].

1.3.1腸道粘膜物理屏障 物理屏障又稱機(jī)械屏障，由腸粘膜上皮細(xì)胞及其間緊密連接組成的腸道上皮完整的結(jié)構(gòu)組成，是腸道屏障中尤為重要的一部分。腸道上皮細(xì)胞緊密排列，通過細(xì)胞間連接復(fù)合體調(diào)控細(xì)胞旁路通透性和上皮屏障的完整性。這些鏈接復(fù)合體包括緊密連接(tight junction,TJ)、黏著連接(adherence junction,AJ)、橋粒(desmosome)和間隙連接(gap junction,GJ)等(圖3)[7]。TJ是連接相鄰細(xì)胞間的狹窄嵴線，是阻止腸腔毒素進(jìn)入組織、封閉細(xì)胞間隙的重要結(jié)構(gòu)，在調(diào)控上皮細(xì)胞旁路的流量速度上有一定作用，也是區(qū)分細(xì)胞刷狀緣與基側(cè)膜的標(biāo)志[8]；AJ位于緊密連接下方，在細(xì)胞間的黏附與胞內(nèi)信號傳遞上起著作用[9]；橋粒則起到鏈接相鄰細(xì)胞的作用[10]；GJ可在細(xì)胞間形成電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)，對神經(jīng)沖動傳遞起作用，并連通細(xì)胞，形成胞間小分子代謝物和信號分子的水性通道。

圖3 腸道上皮細(xì)胞中細(xì)胞間連接的分子結(jié)構(gòu)Fig. 3 Molecular structure of the intercellular junction of intestinal epithelial cells

該圖基于文獻(xiàn)[7-9]制作。

Fig. 3 was made referred to reference [7-9].

TJ在免疫屏障中起重要作用，其通透性決定著整個腸道上皮屏障的功能。研究發(fā)現(xiàn)，TJ主要有3種整合蛋白，即閉鎖蛋白(occluding)、閉合蛋白(claudin)和連接黏附分子(junctional adhesion molecule,JAM);前兩者構(gòu)成了TJ的主鏈，是多跨膜蛋白，主要負(fù)責(zé)相鄰兩個細(xì)胞間小分子物質(zhì)擴(kuò)散與通透性的調(diào)控；JAM在免疫監(jiān)視和炎癥反應(yīng)期間，對免疫細(xì)胞的運(yùn)輸非常重要[11]。研究發(fā)現(xiàn)，claudin執(zhí)行不同的功能，并且可以大致分為兩類：涉及屏障形成(降低細(xì)胞旁路滲透性)和通道孔隙形成(增加細(xì)胞旁路滲透性)。在腸道中，claudin-1,-3,-4,-5,-8,-9,-11,-14與屏障的形成有關(guān)，claudin-2,-7,-12,-15與孔隙的形成有關(guān)[12]。Claudin封閉相鄰兩個細(xì)胞的間隙，而3個上皮細(xì)胞間屏障的連接則是由tricellulin蛋白來調(diào)控的，tricellulin基因表達(dá)的抑制影響了上皮屏障的完整性[13]。閉鎖小帶(zonula occludens,ZO)是TJ的特異性蛋白，是膜相關(guān)的鳥苷酸激酶同系物(membrane-associated guanylate kinase,MAGUK)家族的成員，ZO的特殊結(jié)構(gòu)在TJ中提供了細(xì)胞內(nèi)支架并起著調(diào)節(jié)和維持其結(jié)構(gòu)的作用[11]。

1.3.2腸道粘膜化學(xué)屏障 腸粘膜化學(xué)屏障主要是指覆蓋在腸上皮細(xì)胞的黏液層。黏液層是由腸黏液腺和上皮杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的，附著在粘膜表面一定厚度的疏水黏液被，其主要成分為黏蛋白(mucin，MUC)、SIgA、水、電解質(zhì)，并伴有細(xì)胞碎片與常駐菌群。黏液被覆蓋在粘膜表面，遮蓋了粘膜表面的糖蛋白和糖脂受體，阻止了細(xì)菌的附著；黏液中的糖蛋白和糖脂則充當(dāng)了細(xì)菌黏附受體的類似物，改變了細(xì)菌的進(jìn)攻位點(diǎn)，使細(xì)菌結(jié)合到黏蛋白和糖脂上，并隨糞便排出體外[14]；同時黏液被保證了上皮細(xì)胞不受腸腔滲透壓的影響。

MUC是一類高度糖基化的大分子黏蛋白，依其結(jié)構(gòu)及分布可分為兩類(圖4)：一類為經(jīng)典的凝膠形成黏蛋白[gel-forming mucin，包括MUC2(腸黏蛋白)、MUC5AC、MUC5B和MUC6]，主要形成巨大的聚合物；另一類為跨膜黏蛋白(transmembrane mucin，包括MUC1、MUC3、MUC4、MUC12、MUC13、MUC16和MUC17)，覆蓋于上皮細(xì)胞頂端表面，具有細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)和巨大胞外黏蛋白域，其分子質(zhì)量在1 mu到10 mu以上(MUC13除外)[15]。

圖4 腸道內(nèi)兩種不同類型的黏蛋白： 凝膠形成黏蛋白與跨膜黏蛋白Fig. 4 Two different types of intestinal mucins: Gel-forming and transmembrane mucins

該圖基于文獻(xiàn)[15]制作。

Fig. 4 was made referred to reference [15].

MUC2主要是由腸道內(nèi)杯狀細(xì)胞和少量上皮細(xì)胞分泌的黏蛋白組成，是構(gòu)成腸黏液層主要成分，其形成的聚合物在100 mu以上。MUC2初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在高爾基體上通過二硫鍵形成二聚體[16]，并裝配O-聚糖鏈?zhǔn)狗肿淤|(zhì)量達(dá)到5 mu左右，在產(chǎn)物外排的囊泡階段中，二聚體的N-末端通過二硫鍵連接為三聚體(圖5A)[15]，一旦從細(xì)胞中釋放后，MUC2分子便擴(kuò)大，形成由二聚體C末端和三聚體N末端相連的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖5B)。同時MUC2中含有兩個或多個CysD結(jié)構(gòu)域，可通過非共價鍵形成非常穩(wěn)定的非共價二聚體[17]，使MUC2在高離子液鹽中保持不溶性，因此，網(wǎng)狀的外部結(jié)構(gòu)配合共價鍵與非共價鍵的交聯(lián)，使得MUC2構(gòu)成的凝膠黏液層結(jié)構(gòu)牢固并保持高度穩(wěn)定性，起到有效保護(hù)上皮細(xì)胞，發(fā)揮屏障保護(hù)的作用。

1.3.3腸道粘膜微生物屏障 微生物屏障是腸道內(nèi)正常菌群在腸道內(nèi)定植形成的微生態(tài)系統(tǒng)。研究表明，腸道內(nèi)厭氧菌能夠通過磷壁酸與腸粘膜上皮細(xì)胞結(jié)合，可有效阻止致病菌的定植與入侵；厭氧菌不僅產(chǎn)生維生素等供機(jī)體利用，而且產(chǎn)生的乳酸和短鏈脂肪酸等還可降低腸道pH，抑制致病菌生長；其中，丁酸作為腸道上皮細(xì)胞的能量物質(zhì)，對腸道上皮細(xì)胞的增殖與分化，以及腸道緊密連接的形成起著作用[18]；同時常駐菌群多帶有抗原性，可刺激特異性免疫系統(tǒng)的成熟，抵御病原菌入侵。

除此之外，腸道節(jié)律性的蠕動，使腸內(nèi)容物不斷向后推動，加之粘膜層的部分黏液夾雜脫落的上皮細(xì)胞碎片對病原菌的機(jī)械阻擋作用，使腸道粘膜非特異性免疫系統(tǒng)充分地發(fā)揮了阻擋病原菌入侵、保護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。

1.4 常用的反映腸道粘膜免疫屏障的指標(biāo)

1.4.1腸道通透性 腸道通透性是指腸腔內(nèi)分子質(zhì)量在150 u以上的物質(zhì)以非通道或載體介導(dǎo)的被動擴(kuò)散的方式通過腸粘膜的能力[19]。腸道通透性是監(jiān)測腸道免疫屏障功能的重要指標(biāo)，其改變可以準(zhǔn)確反映腸粘膜的損傷程度。腸粘膜通透性的增加，表明腸粘膜完整性受到破壞，腸道屏障功能受損。

圖5 MUC2的結(jié)構(gòu)Fig. 5 Structure of MUC2

該圖基于文獻(xiàn)[15]制作。

Fig. 5 was made referred to reference [15].

目前檢測腸道通透性的方法主要有糖分子探針法、聚乙二醇類及同位素標(biāo)記等方法，其中以非代謝性低聚糖的糖分子探針方法最為常用，其中又以雙糖分子乳果糖/甘露糖(lactulose/mannitol,L/M)探針為代表。與其他糖分子探針相比，乳果糖和甘露醇的回收率較高，受腸道內(nèi)滲透壓影響較小，是比較理想的糖分子探針[20]。乳果糖是雙糖分子，分子質(zhì)量較大(Mr=342,直徑0.92 nm), 通過腸粘膜上皮細(xì)胞間的緊密連接吸收，這也是細(xì)菌及內(nèi)毒素進(jìn)入體內(nèi)的主要途徑，因此，乳果糖的通透性反映了腸粘膜屏障的狀態(tài)。甘露醇是單糖分子，分子質(zhì)量較小(Mr=182，直徑0.68 nm),主要通過腸粘膜上皮細(xì)胞的微孔吸收。而且這兩個分子結(jié)果穩(wěn)定，無毒，無免疫原性，在體內(nèi)不代謝，以尿中等量原型排出。通過口服，檢測吸收比可準(zhǔn)確反映腸粘膜通透性及粘膜屏障功能。尿中L/M比值升高代表腸粘膜緊密連接部不完善，腸道通透性增大，腸粘膜屏障功能受損。近年來，由于氣相和液相色譜法檢測L/M比值較準(zhǔn)確、快速，已被廣泛應(yīng)用[21]。

1.4.2二胺氧化酶 二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)是具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，普遍存在于哺乳動物腸粘膜上皮絨毛中，以小腸中活性最高，而幾乎不存在于其他組織或細(xì)胞中。生理狀態(tài)下，血漿中DAO活性很低，當(dāng)腸粘膜屏障完整性受損時，腸上皮釋放大量DAO進(jìn)入血液，或隨壞死粘膜進(jìn)入腸腔混入食糜中，因此，DAO活性能夠反映腸粘膜屏障的完整性，是腸粘膜功能狀態(tài)的敏感指標(biāo)[22]。臨床上通常通過測定血清、粘膜組織或腸道食糜中DAO活性，來反映腸粘膜屏障，特別是在無創(chuàng)條件下，血清中DAO活性更能直接地反映腸上皮細(xì)胞及腸道功能的完整性，是監(jiān)測腸粘膜屏障損傷程度的重要指標(biāo)。

2 常見植物提取物種類及其對腸道健康與免疫的調(diào)控功能

植物提取物是從植物的莖、葉或根中提取的天然活性物質(zhì)，近年來在畜禽養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用，主要的活性成分包括多糖、植物精油、黃酮類、生物堿、皂甙、多酚類等物質(zhì)。在生產(chǎn)中，發(fā)揮著改善生產(chǎn)性能，抗氧化、抗病毒，提高機(jī)體免疫力，預(yù)防畜禽疾病，改善腸道健康等重要的作用[23-24]。

其中，多糖類、多酚類、皂甙、精油及醇類提取物被證明有著顯著改善機(jī)體腸道健康，提高腸道免疫的功能。其對腸道的改善作用主要包括：1)改善腸道環(huán)境，增強(qiáng)消化酶活性，提高消化機(jī)能；2)促進(jìn)腸道形態(tài)發(fā)育，改善黏膜形態(tài)；3)調(diào)控腸道菌群，提升腸道屏障功能[25]；4)維持腸道特異性免疫，提高免疫應(yīng)答敏感度，消除腸道氧化損傷[26]。植物提取物對腸道具有營養(yǎng)和保健的雙重功效，是腸道改善型抗生素的理想替代品。

近幾年，植物提取物對腸道免疫的調(diào)控作用逐漸引起了人們的重視，并且在細(xì)胞及分子上的作用機(jī)制也逐漸被探索。目前發(fā)現(xiàn)的作用機(jī)制主要包括：1)提高腸道特異性免疫系統(tǒng)，通過識別免疫細(xì)胞特異性膜受體，激活免疫應(yīng)答，消除炎癥，保護(hù)腸上皮細(xì)胞[27]；2)維持腸道黏膜完整性，激活腸上皮細(xì)胞物理屏障相關(guān)信號通路，阻止病原菌入侵[28]；3)增加腸道黏蛋白分泌，提高防御能力[29]；4)調(diào)控腸道菌群，促進(jìn)SIgA分泌，清除病原菌[2]；5)提高養(yǎng)分消化率，降低腸道有害代謝產(chǎn)物如尿酸、尿素氮的含量，維持腸道健康。

3 植物提取物對腸道粘膜關(guān)鍵蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制

3.1 對TJ的調(diào)控通路

TJ結(jié)構(gòu)的組裝、分解和維持受到各種病理性和病原性刺激物的影響，TJ的調(diào)節(jié)，以及細(xì)胞膜蛋白與肌動蛋白之間的交互作用主要受到以下幾個信號通路的影響：蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs),肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)以及Rho家族的GTP酶[30]。

TJ的磷酸化作用影響到上皮屏障的功能，同時claudin蛋白的磷酸化影響到TJ滲透性的升降，而且研究發(fā)現(xiàn)，occludin也通過磷酸化作用與TJ相聯(lián)系[31]。在上皮細(xì)胞內(nèi)，PKC是一個重要的蛋白，其不同的亞型介導(dǎo)了多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[32]。TLR2(Toll-like receptor 2)是重要的微生物識別與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，在上皮細(xì)胞中，對TLR2的刺激激活了PKCα與PKCδ蛋白，繼而增加了跨上皮細(xì)胞電阻(trans epithelial electrical resistance,TEER)和ZO-1的重新分配[33]。MAPK可對各種刺激或生長因子做出響應(yīng)，其中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)可直接作用于occludin蛋白的C-末端阻止過氧化氫誘導(dǎo)的TJ的斷裂[34]，白藜蘆醇能夠活化PKC，增加MAPK的基因表達(dá)水平，促進(jìn)Caco-2細(xì)胞TJ相關(guān)基因和蛋白 (claudin-1,occludin和ZO-1)的表達(dá)[35]。

MLCK是介導(dǎo)調(diào)控TJ滲透性多條通路的關(guān)鍵的中間元件，例如影響TJ屏障的細(xì)胞因子、菌群等。肌球蛋白環(huán)的收縮很大程度上是由MLCK磷酸化后的肌球蛋白Ⅱ調(diào)節(jié)輕鏈 (myosin Ⅱ regulatory light chain,MLC) 所調(diào)控，進(jìn)而影響TJ的組裝和調(diào)控。Shen等[36]發(fā)現(xiàn)，在Caco-2細(xì)胞系中，誘導(dǎo)型啟動子控制的MLCK突變體的連續(xù)表達(dá)，導(dǎo)致了TEER的降低與ZO-1和occludin的重新分配。中藥提取物亦能夠提高Caco-2細(xì)胞的TEER，降低細(xì)胞通透性，并可調(diào)節(jié)claudin-2保護(hù)Caco-2細(xì)胞的功能[37]。

Rho GTP酶介導(dǎo)的TJ調(diào)控通路比較復(fù)雜，Rho的失活導(dǎo)致ZO-1與occludin背離細(xì)胞膜，以及F肌動蛋白(F-actin)功能的重組，進(jìn)而導(dǎo)致TEER的降低與細(xì)胞旁路通量的增加[38]。然而Rho的激活會使MLC磷酸化，誘導(dǎo)肌動蛋白環(huán)的收縮，進(jìn)而增加了TJ的分解。植物提取物中的低聚糖能夠通過Rho相關(guān)激酶增強(qiáng)上皮細(xì)胞TJ功能的恢復(fù)[39]。

當(dāng)腸道炎癥發(fā)生時，TJ會受到影響。對于LPS誘導(dǎo)的損傷，黃芪苷與黃芪(Astragaluslinn)多糖均被證實(shí)具有緩解損傷的作用，能夠顯著提高ZO-1與occludin的mRNA水平，上調(diào)ZO-1的蛋白表達(dá)，并可恢復(fù)LPS造成的ZO-1的連接與分布[28,40]；從刺五加(Acanthopanaxsenticosus)中提取的多糖在維持occludin,ZO-1蛋白的重新分配與表達(dá)上發(fā)揮重要作用，并可通過抑制NF-κB/MLCK通路的激活，促進(jìn)F-actin的磷酸化[41]。

3.2 對MUC2的調(diào)控通路

MUC2是腸道杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的分泌型糖蛋白，是腸上皮黏液的主要成分，有著保護(hù)腸上皮的功能，然而，其在免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全清楚。包括MUC2在內(nèi)的腸道黏蛋白主要受到副交感神經(jīng)的控制；在結(jié)腸癌細(xì)胞中，IL-4、IL-13或TNF-α則能夠通過特定的信號通路MAPK激活MUC2的mRNA表達(dá)[6]。

腸上皮細(xì)胞能夠通過TLR與NLR(NOD-like receptor)信號通路直接對病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)做出響應(yīng)，導(dǎo)致黏蛋白基因表達(dá)的改變[42]。腸道炎癥發(fā)生時，巴西人參(Pfaffiapaniculata)提取物能夠刺激粘膜上皮細(xì)胞，增加MUC3和MUC4的分泌水平，緩解腸炎[43]。

腫瘤抑制基因p53是人類惡性腫瘤中頻繁突變的基因，p53蛋白是轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)參與細(xì)胞周期進(jìn)程，DNA修復(fù)、凋亡等許多生長控制基因的表達(dá)[44]。研究證實(shí)，MUC2基因的啟動受到p53蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，細(xì)胞應(yīng)激可能通過p53產(chǎn)生MUC2促進(jìn)受損細(xì)胞周圍保護(hù)屏障的構(gòu)建[45]。植物中的活性成分，如茶多酚、黃酮能夠通過p53轉(zhuǎn)錄激活MUC2基因表達(dá)[46]。

MUC2等黏蛋白的表達(dá)還受到其他植物成分的影響，飼喂靈芝(Ganoderma)水提物(主要功能成分為多酚)能夠顯著提高大鼠排泄物中MUC含量，起到改善腸道免疫和屏障功能的作用[29]。肉仔雞日糧中添加丹參精油后，回腸MUC及杯狀細(xì)胞的數(shù)量顯著提高[47]；姜黃(Curcumalonga)、百里香(Thymus)和肉桂(Cinnamomumcassia)提取物也被證實(shí)具有增加肉雞小腸MUC2基因表達(dá)和改善腸道消化和防御能力的作用[48]。

4 植物提取物對其他腸道主要免疫指標(biāo)的影響

4.1 調(diào)控細(xì)胞因子分泌，維持腸道免疫

細(xì)胞因子是多種免疫細(xì)胞應(yīng)答炎癥反應(yīng)時釋放的一類非抗體、非補(bǔ)體的能夠調(diào)節(jié)免疫功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化，參與炎癥反應(yīng)的小分子多肽物質(zhì)[49]。而在腸道免疫中，細(xì)胞因子對腸道粘膜特異性免疫和非特異性免疫屏障起著不同的功能，這源于細(xì)胞類型的不同。

在腸道特異性免疫中IFN-γ、IL-2、IL-4等細(xì)胞因子具有特殊且重要的意義。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，參與誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫；IL-4是由Th2細(xì)胞分泌，參與促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖分化，增強(qiáng)體液免疫[50]。Th1、Th2細(xì)胞的穩(wěn)定對維持腸道免疫功能至關(guān)重要，IFN-γ、IL-4的水平則體現(xiàn)出Th1與Th2細(xì)胞的活性，反映腸道細(xì)胞免疫與體液免疫的狀態(tài)。IL-2對免疫反應(yīng)的性質(zhì)有著顯著影響，有利于Th1和Th2細(xì)胞的免疫應(yīng)答。從枸杞(Luoiumbargarum)與茯苓(Poriacocos)中提取的多糖能夠提高免疫抑制下小鼠腸道粘膜中IFN-γ和IL-4的分泌水平，維持腸道免疫處于相對穩(wěn)定狀態(tài)[51]。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是腸道內(nèi)誘導(dǎo)粘膜SIgA的重要物質(zhì)，在體外，TGF-β能夠誘導(dǎo)同型IgA向SIgA的轉(zhuǎn)化，而敲除TGF-β基因或缺失TGF-β受體的小鼠IgA響應(yīng)受到抑制[52]。Xie等[53]發(fā)現(xiàn)口服白術(shù)(Atractylodismacrocephalae)多糖可顯著(P<0.05)提高小鼠十二指腸中TGF-β和IL-6和TNF-α的mRNA的表達(dá)量。IL-17是促使白細(xì)胞處理炎癥的重要細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、T細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，從淫羊藿提取的多糖可促進(jìn)小腸IL-17分泌，提高腸道免疫[54]。

在腸道非特異性粘膜免疫屏障系統(tǒng)中炎癥因子起到促炎的作用[55-56]，特別是對體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的物理屏障，其作用機(jī)制尚不清楚，但這可能是因?yàn)轶w外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞微生物屏障與化學(xué)屏障功能不完善導(dǎo)致的。研究已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞因子如IFN-γ能夠增加體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的通透性，并通過NO調(diào)控實(shí)現(xiàn)[57]。黃芪多糖能夠顯著下調(diào)體外培養(yǎng)的Caco2細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-8的分泌水平[40]，緩解LPS對細(xì)胞的損傷。細(xì)胞因子在體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞中的具體作用及影響機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

4.2 提高腸道粘膜免疫SIgA分泌水平

腸道內(nèi)SIgA是腸道免疫非常重要的成分，由粘膜固有層的漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生，并通過上皮細(xì)胞進(jìn)入腸腔內(nèi)，為粘膜表面提供多重保護(hù)作用。并且它可以選擇性地轉(zhuǎn)移到其他粘膜組織，從而建立一種廣泛而穩(wěn)定的黏液屏障系統(tǒng)，防止病原微生物入侵[58]。SIgA多以四聚體和二聚體形式存在，具有4或8個抗原結(jié)合位點(diǎn)，比單體SIgA具有更高的親和性，因此在中和腸道內(nèi)毒素，阻止病原侵入，抑制病原微生物在腸上皮細(xì)胞的黏附和定殖方面發(fā)揮重要的功能。且其分泌細(xì)胞數(shù)量也常被用作評價腸道粘膜免疫的指標(biāo)，從中草藥中提取的多糖多具有提高小腸中IgA+分泌細(xì)胞數(shù)量的作用[59]，在H22肝癌耐受小鼠中，靈芝多糖的添加能夠顯著增加小腸中IgA+細(xì)胞數(shù)量[60]。此外據(jù)報道，SIgA能夠增強(qiáng)腸道黏液的親和力，調(diào)控IgG介導(dǎo)的反應(yīng)以助于隔離細(xì)菌與粘膜的接觸，并抑制感染部位的炎癥反應(yīng)，同時作為腸道分泌最多的免疫球蛋白，其分泌水平反映了粘膜免疫機(jī)制的成熟度，是腸道屏障功能的重要貢獻(xiàn)者[61]。而植物提取物作為一種天然活性物質(zhì)在一定程度上能夠促進(jìn)SIgA分泌，從淫羊藿提取的多糖可顯著提高肉仔雞十二指腸和空腸中SIgA的分泌，增強(qiáng)粘膜免疫[29]。SIgA的分泌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化受到TGF-β的調(diào)控，白術(shù)多糖能夠通過提高十二指腸中TGF-β基因表達(dá)水平而促進(jìn)SIgA的分泌[46]，提高粘膜免疫。

4.3 調(diào)節(jié)腸道粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的分泌量

NO是一種生物信息傳遞載體，能保護(hù)機(jī)體非特異性免疫和維持機(jī)體微循環(huán)內(nèi)環(huán)境的恒定，是體內(nèi)非特異性防御反應(yīng)系統(tǒng)的組成部分，在血管調(diào)節(jié)、神經(jīng)信息的傳遞及免疫功能調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[62]。在機(jī)體內(nèi)，NO通過非特異性殺傷寄生蟲、細(xì)菌、真菌及腫瘤細(xì)胞起到增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫的功能。胃腸道巨噬細(xì)胞的最主要功能之一是殺死并清除穿過上皮細(xì)胞的細(xì)菌，而NO能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能，例如抑制多種細(xì)胞因子如干擾素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等的合成，保護(hù)胃腸主要細(xì)胞免于損傷，對粘膜防御具有重要的意義[63]。在腸道內(nèi)，NO能夠抑制中性粒細(xì)胞附著于腸系膜內(nèi)皮，阻斷血小板黏連，防止肥大細(xì)胞活化，保護(hù)胃腸粘膜免受各種刺激。但NO的調(diào)控具有雙向性，在腸道早期損傷時，如發(fā)生中性粒細(xì)胞黏附、局部缺血或肥大細(xì)胞活化，NO起到保護(hù)腸道粘膜屏障的作用；在強(qiáng)炎癥時，抑制NO的合成可改善屏障紊亂。Guo等[64]發(fā)現(xiàn)積雪草苷(Asiaticoside)具有抗炎特性，能夠通過抑制NO的合成促進(jìn)胃腸炎癥的愈合，因?yàn)檫^高的NO可能直接損傷粘膜，破壞actin細(xì)胞骨架，抑制ATP形成，擴(kuò)張緊密連接，顯著增加腸道滲透性，損傷腸道粘膜[65]。NO合成酶 (inducible nitric oxide synthase,iNOS) 抑制劑能夠阻止IFN-γ引起的腸道通透性的增加[49]，紅葡萄酒中的多酚可通過抑制iNOS的基因表達(dá)水平來減少結(jié)腸腫瘤發(fā)生的幾率[66]。此外，腸道黏液層是保護(hù)上皮細(xì)胞免于物理損傷，減少細(xì)菌對上皮的黏附和粘膜侵襲的重要屏障，低量NO能夠引發(fā)胃腸黏液的釋放。有研究表明，橡樹(Quercusdentata) 和石榴(Punicagranatum)中的多酚提取物能夠降低體外培養(yǎng)的腸道Caco-2細(xì)胞中NO的合成量，緩解炎癥損傷[67]?？傮w而言，維持較低劑量的NO對腸道粘膜屏障起到保護(hù)的作用。

4.4 對微生物菌群的影響

腸道微生物是腸道粘膜屏障的重要影響因素，它不僅構(gòu)成了粘膜微生物屏障，同時對腸道通透性，TJ的裝載、構(gòu)建以及MUC2的合成、分泌有著不可忽視的作用[68]。植物提取物被畜禽攝入后，可以通過提高腸道上皮的免疫防御機(jī)制，抵抗病原微生物引起的腹瀉。研究表明，植物提取物的疏水性能夠使細(xì)菌細(xì)胞膜和線粒體膜上磷脂分開，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增大通透性，引起胞內(nèi)離子等內(nèi)容物外流，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[69]。牛至中香芹酚可破壞綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌的磷酸分子，導(dǎo)致細(xì)菌失活[70]。石榴提取物能夠增加糞便雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量，減少大鼠炎癥標(biāo)志物[25]。腸道菌群的改善不僅減少了腹瀉，對粘膜免疫屏障也起著重要的影響。腸道內(nèi)有益菌，如枯草芽孢桿菌的增多可以顯著改善腸道形態(tài)，提高杯狀細(xì)胞的數(shù)量，同時還能夠提高occludin,claudin-2與claudin-3的基因表達(dá)水平[71]，乳桿菌能夠調(diào)控TJ蛋白組的特性，并對化學(xué)誘導(dǎo)的上皮屏障損傷起到保護(hù)作用[72]。綠茶提取物[73]和白藜蘆醇[74]都可顯著增加腸道內(nèi)乳酸桿菌或雙歧桿菌的數(shù)量，改善腸道健康。在肉仔雞日糧中添加5%牛至精油能夠顯著增加回腸絨毛高度和乳酸菌數(shù)量，減少回腸和盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量[75]。

5 小結(jié)

植物提取物特別是植物多糖、多酚、精油作為天然功能性飼料添加劑，在機(jī)體細(xì)胞免疫和腸道免疫方面均發(fā)揮著重要作用。但目前對植物提取物在畜禽腸道健康的研究大多停留在改善腸道內(nèi)環(huán)境、腸道結(jié)構(gòu)與微生物菌群方面，在改善腸道屏障、粘膜免疫，特別是包括緊密連接和黏蛋白在內(nèi)的對深層機(jī)理的研究尚且不足。探索植物提取物增強(qiáng)粘膜免疫的深層機(jī)理，對開發(fā)新型腸道健康促進(jìn)劑，防治腸道疾病具有十分重要的意義。