馬建兵 翟永亮 農(nóng)大官 李菁華 付航 張興華李明 陸穎 徐春華?

1)(中國科學院物理研究所,北京凝聚態(tài)物理國家研究中心,軟物質(zhì)物理重點實驗室,北京 100190)2)(中國科學院大學物理科學學院,北京 100049)3)(武漢大學生命科學學院高等研究院,武漢 430072)

(2018年3月14日收到;2018年4月8日收到修改稿)

磁鑷是一種高精度的單分子技術(shù),它用磁場對連有生物大分子的超順磁球產(chǎn)生磁力,通過追蹤磁球的位置來測量生物大分子的長度信息.磁鑷包括橫向磁鑷和縱向磁鑷.縱向磁鑷空間精度高,但昂貴;橫向磁鑷簡單便宜,但由于受其成像原理的限制,一般情況下只能連接較長的DNA等生物大分子,且其空間精度較差,進而限制了其應(yīng)用范圍.為了解決這個問題,本文改進了橫向磁鑷,用片層光照明的方法使光線主要被磁球散射,從而能夠直接觀察到吸附在樣品槽側(cè)壁上的磁球,這使得測量短連接的底物成為可能.對于實際應(yīng)用的檢測,首先測試了包含270 bp發(fā)卡結(jié)構(gòu)的0.5μm雙鏈DNA,用其中發(fā)卡結(jié)構(gòu)的“折疊-去折疊”跳變過程證明了改進后的橫向磁鑷的確可以追蹤短DNA等生物大分子.然后,進一步用16μm的λ-DNA檢驗了實驗系統(tǒng).最后,將新型橫向磁鑷與普通橫向磁鑷及縱向磁鑷在小力和大力條件下拉伸不同長度DNA的噪聲進行了比較,發(fā)現(xiàn)改進后的橫向磁鑷在空間精度上明顯優(yōu)于普通橫向磁鑷,與縱向磁鑷相比也無明顯差異.以上結(jié)果證明了改進后的橫向磁鑷的精度優(yōu)勢,并擴展了橫向磁鑷的應(yīng)用范圍.

1 引 言

單分子技術(shù)可以直接測量單個分子的動力學過程等系綜實驗難以獲得的重要信息.20世紀90年代以來,單分子技術(shù)快速發(fā)展[1?5],這些技術(shù)主要被用來研究DNA或蛋白質(zhì)或它們之間的相互作用,得到了大量重要結(jié)果,這些技術(shù)主要包括光鑷[6?11]、磁鑷[12?16]、原子力顯微鏡[17]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移[7,18?19]和單分子熒光成像[20?23].其中,磁鑷的一個重要優(yōu)點是它可以同時對多個單分子進行高通量的測試,實驗效率較高,從而被廣泛使用[24].

一般地,磁鑷樣品槽內(nèi)表面通過化學修飾連接DNA等大分子,在DNA分子另一端連接微米量級的超順磁球,再通過磁鐵操縱超順磁球,最后用成像裝置來追蹤超順磁球的位置從而獲得DNA的長度信息.實驗測得的數(shù)據(jù)不可避免地有一定的噪聲,對噪聲的成因分析有助于提高儀器的性能.

其中?δx2是磁球在垂直于力的X方向上振動方差的平均值;kB是玻爾茲曼常數(shù);T是熱力學溫度;kDNA是DNA的彈性系數(shù).

另一方面,在0.1—10.0 pN的拉力范圍內(nèi),描述雙鏈DNA(dsDNA)響應(yīng)拉伸力的最好模型是蠕蟲鏈(worm-like-chain,WLC)模型:

其中A是DNA的駐留長度;L0是DNA的輪廓長度;L是DNA沿拉力方向的伸長;F是DNA兩端的力;根據(jù)胡克定律,對(2)式求偏導(dǎo)?F/?L就是DNA的彈性系數(shù)kDNA.進而得到磁鑷在力方向上的噪聲

也就是說,在F固定的條件下,DNA在力方向伸長的噪聲與DNA輪廓長度的平方根成正比.所以DNA越短,系統(tǒng)的空間分辨率越高.

較早的磁鑷研究中常選用較長的DNA來研究DNA的彈性性質(zhì)[25,26];隨著對儀器測量精度要求越來越高,人們開始在磁鑷中使用短DNA[27].磁鑷分為縱向磁鑷和橫向磁鑷:當光路和磁球受力在同一個方向叫作縱向磁鑷,當兩者垂直時叫作橫向磁鑷.由于縱向磁鑷可以連接較短的DNA或蛋白質(zhì),所以它的空間分辨率可以更高,但縱向磁鑷需要壓電陶瓷和大數(shù)值孔徑(NA)目鏡等昂貴元件.雖然橫向磁鑷儀器更加簡單便宜,但是由于樣品槽側(cè)壁在顯微鏡里形成一段幾微米寬的陰影區(qū),當磁球離側(cè)壁太近時其成像就會受到干擾,所以一直以來無法用來測量較短的DNA或蛋白質(zhì);而長DNA的使用則導(dǎo)致噪聲較大,空間分辨率較低,限制了其應(yīng)用范圍.

為了解決橫向磁鑷的這個問題,本文用毛細玻璃管作為樣品槽,激光作為光源,經(jīng)過柱面鏡聚焦到與樣品槽側(cè)壁相連的超順磁球上,磁球的散射光被顯微鏡系統(tǒng)的探測器收集,在計算機上實時顯示.用這種片層光照明的方法,實現(xiàn)了對直接固定在毛細管側(cè)壁上的磁球的觀察.然后,用輪廓長度為0.5μm包含270 bp發(fā)卡結(jié)構(gòu)(hairpin)的dsDNA和輪廓長度為16.4μm的λ-DNA檢驗了系統(tǒng)的可靠性.最后,對比了新型橫向磁鑷拉伸不同長度DNA的噪聲,發(fā)現(xiàn)小力條件下短DNA的噪聲明顯小于長DNA;對比了新型橫向磁鑷和縱向磁鑷拉伸短DNA的噪聲,發(fā)現(xiàn)小力條件下簡單的新型橫向磁鑷的噪聲和復(fù)雜的縱向磁鑷無明顯區(qū)別.以上結(jié)果證明了新型橫向磁鑷在不明顯增加設(shè)備成本的條件下,的確提高了精度,且能夠追蹤短DNA,RNA或蛋白質(zhì),擴展了橫向磁鑷的應(yīng)用范圍.

2 實驗方法和材料

2.1 光路原理和結(jié)構(gòu)

傳統(tǒng)的橫向磁鑷技術(shù)用的是倒置光學顯微鏡的明場照明[24].圖1(a)所示的是改進的高精度橫向磁鑷的光路原理:一束普通的平行激光,經(jīng)過柱面鏡匯聚成一條焦線.這是因為柱面鏡跟球面鏡不同:球面鏡在平面的各個方向的焦距相同,可以把一束光聚焦成為一個點;而柱面鏡只在平面內(nèi)的其中一個方向上聚焦,在其他方向上都沒有聚焦效果,從而把一束光聚焦成一條線.

調(diào)節(jié)焦線位置使其剛好照射到連接在毛細管左側(cè)內(nèi)壁的磁球上.被磁球散射的光被普通40×的物鏡收集,在錄像設(shè)備(CCD,型號為GE680)上成像,并在計算機上用灰度重心法實時追蹤磁球的位置.釹鐵硼磁鐵位于磁球的另一側(cè),對磁球施以皮牛(pN)量級的拉力,操縱和磁球相連的DNA,RNA或蛋白質(zhì).激光、磁球和磁鐵沿X軸方向成一條直線.圖1(b)展示了新型橫向磁鑷的裝置設(shè)計圖,其中激光器購于北京世峰多光科技有限公司,型號是12×35 APCMD,價格約100元.一方面:片層光的厚度越窄,磁球散射的光越強,采集到的信號就更強,原則上能達到的定位精度更高;另一方面:由于磁球分散在側(cè)壁上不同的位置,為了一次觀察到較多磁球,需要保留足夠的照明區(qū)域.激光經(jīng)過焦距為80 mm的柱面鏡聚焦后,聚焦后焦線如圖1(c)所示,其半高全寬(FWHM)為275μm(圖1(d)),這個寬度可以在一定程度上兼顧精度和照明范圍.片層光照明使光線主要照射到微米級的磁球上,使得這種橫向磁鑷裝置成為一種暗場照明,接收不到除磁球散射之外的光.如圖1(e)所示,是CCD采集到的直徑為2.8μm的超順磁球的圖像.與之對比的是圖1(f)中傳統(tǒng)橫向磁鑷得到的相同磁球的圖像.

文中用到的傳統(tǒng)橫向磁鑷原理參考文獻[28],用到的物鏡及軟件和新型橫向磁鑷相同.文中用到的縱向磁鑷儀器物鏡的放大倍數(shù)是100×,NA值是1.49,追蹤軟件基于磁球衍射環(huán)隨焦面的變化規(guī)律編寫,具體參考文獻[29].

圖1 片層光照明的橫向磁鑷示意圖 (a)光路原理圖;(b)裝置設(shè)計圖;(c)聚焦后激光的焦線;(d)焦線寬度方向上的光強分布;(e)新型橫向磁鑷磁球的暗場成像圖;(f)傳統(tǒng)橫向磁鑷磁球的明場成像圖Fig.1.Schematic diagram of light sheet illuminative transverse magnetic tweezers(TMT):(a)Light after focusing;(b)installation plan;(c)light after focusing;(d)intensity profile along the width direction of the light after focusing;(e)micrograph of a 2.8μm diameter super paramagnetic bead by the novel TMT;(f)micrograph of a 2.8μm diameter super paramagnetic bead by the traditional TMT.

2.2 DNA的結(jié)構(gòu)

實驗用到的DNA有兩種,一種是輪廓長度為16.4μm的λ-DNA,另一種是輪廓長度為0.5μm帶有270 bp hairpin的雙鏈DNA.其中,λ-DNA(購于NEB公司)兩端分別連上修飾了生物素(biotin)或地高辛(digoxigenin)的12個堿基的小片段(3′biotin-cccgccgctgga和 3′digoxigenin-tccagcggcggg,生工生物工程(上海)股份有限公司).另外一個0.5μm帶有270 bp hairpin的dsDNA制備方法及序列見參考文獻[30].在離hairpin開口端大約90 bp附近有一個GC豐富區(qū),會導(dǎo)致在14 pN附近打開hairpin時先打開前約90 bp.

2.3 緩沖液

PBS 緩沖液(20 mmol·L?1Na2HPO4,pH=8.0,150 mmol·L?1NaCl)經(jīng)高溫高壓滅菌處理后用孔徑為 0.2μm的濾膜過濾.鈍化緩沖液(passivation buffer,PB)(10 mmol·L?1PB,pH=8.0,1 mmol·L?1乙二胺四乙酸(EDTA),10 mmol·L?1NaN3(高溫撞擊爆炸,劇毒),10 mg/mL牛血清蛋白(BSA),10 mg/mL Pluronic F127)直接用孔徑為0.2μm的濾膜過濾.

2.4 實驗流程

選用的方形毛細管外邊長1 mm,內(nèi)邊長0.5 mm,每段約50 mm.在超聲清洗儀里按順序用甲醇(30 min)和丙酮(30 min)清洗毛細管,再用食人魚洗液(濃硫酸和雙氧水的體積比為7:3,95?C水浴120 min)進一步清洗.然后用Sigmacote(Sigma公司,有毒,10 min)對毛細管內(nèi)壁進行表面預(yù)修飾,最后在烘箱里烘干,置于真空干燥塔(避光)備用.使用毛細管的優(yōu)點一方面是方便使用片層光照明,另一方面是毛細管不用花費時間制作樣品池,且每次可以清洗上千根毛細管,可以節(jié)省大量人力物力.

實驗前先把樣品架用超聲清洗機清洗干凈,然后把毛細管固定在樣品架上,并連好進樣口和出樣口.灌入0.2 mg/mL抗地高辛(Antidigoxigenin,購于Roche Diagnostics,孵育1 h以上).用鈍化緩沖液置換Anti-digoxigenin溶液,孵育至少30 min以防止實驗中的非特異吸附.將100 pmol·L?1DNA與表面修飾了鏈親合素蛋白的順磁性小球(M-280,購于Invitrogen公司)混合20 min,使DNA與磁球相連;然后灌入豎直的樣品槽,使磁球通過重力作用沉降到毛細管的側(cè)壁上,孵育20 min,從而使DNA通過地高辛-抗地高辛的特異性相互作用連在毛細管側(cè)壁.最后用吸水紙或微流泵在出樣口引流,用PBS緩沖液把溶液中自由的磁球慢慢地沖掉.所有實驗的圖像采集速率都是25幀/s.

3 結(jié)果與討論

3.1 直接追蹤吸附到毛細管側(cè)壁上的磁球

片層光照明的方式使這種樣品槽中幾乎只有磁球的散射光線,樣品槽其他位置都不成像,所以這種橫向磁鑷可以直接追蹤吸附到毛細管側(cè)壁上的磁球.在未經(jīng)鈍化處理的樣品槽里連接了如圖2(a)所示的超順磁球,X軸方向為垂直于側(cè)壁的方向也是施加磁力的方向,Y方向為平行于側(cè)壁方向.實驗發(fā)現(xiàn)片層光照明的橫向磁鑷可以直接觀察到緊貼在樣品槽側(cè)壁上的磁球(圖1(e)).

追蹤這種磁球的位置信息,由于X軸所在的方向是用于測量DNA的長度的方向,所以X方向的追蹤噪聲是DNA長度的噪聲.圖2(b)展示了磁球在X方向上一段約100 s的軌跡,追蹤軌跡的噪聲符合高斯分布,噪聲大小為4 nm.

圖2 吸附在毛細管表面磁球的噪聲 (a)磁球固定在毛細管側(cè)壁的示意圖;(b)磁球在X軸上的噪聲Fig.2.Noise of the magnetic sphere on the capillary surface:(a)Schematic diagram of the experiment;(b)noise on the X axis.

3.2 追蹤通過短DNA連接的磁球

為了進一步檢驗片層光照明的橫向磁鑷,將輪廓長度為0.5μm的短雙鏈DNA引入實驗體系.如圖3(a)所示,這個雙鏈DNA帶有一段270 bp hairpin.DNA的這種二級結(jié)構(gòu)會在14 pN附近發(fā)生“折疊-去折疊”兩種狀態(tài)的跳變[31].如圖3(b)所示,把hairpin兩端的磁力加到14 pN,出現(xiàn)了hairpin的“折疊-去折疊”跳變,其中狀態(tài)是折疊態(tài),狀態(tài)是去折疊態(tài).跳變的距離約為270 nm,與在PBS緩沖液里2×270 nt單鏈DNA(ssDNA)的長度約270 nm符合[32].除了“完全折疊”和“完全去折疊”這兩種狀態(tài)之外,還在離“完全折疊”約1/3 hairpin長度的位置出現(xiàn)一個不太穩(wěn)定的亞穩(wěn)態(tài).同時,檢查hairpin序列發(fā)現(xiàn)在這個位置有一段GC豐富區(qū),使得hairpin DNA在這個位置比較穩(wěn)定,導(dǎo)致在14 pN打開hairpin時在這個位置出現(xiàn)一個亞穩(wěn)態(tài).這些細節(jié)與用縱向磁鑷測得的信息完全一致.

圖3 hairpin的折疊去折疊 (a)磁球通過0.5μm,包含270 bp hairpin的dsDNA和側(cè)壁連接的示意圖;(b)270 bp hairpin折疊和去折疊的時間軌跡Fig.3.State transition of the folded and unfolded hairpin:(a)Schematic diagram of a 0.5μm dsDNA with 270 bp hairpin between the bead and the lateral surface;(b)length vs.time curve of the dsDNA containing 270 bp hairpin.

3.3 追蹤通過長DNA連接的磁球

進一步地,把0.5μm的短dsDNA換成16μm長的λ-DNA檢驗片層光照明的橫向磁鑷(圖4(a)).按磁力由大到小的順序?qū)Ζ?DNA進行了拉伸實驗.如圖4(b)所示,磁鐵由近到遠,一共在11個位置停留,每個位置都停留了200 s左右.隨著磁力的減小,相應(yīng)的λ-DNA在X方向上越來越短,且在X和Y方向上的噪聲越來越大.

圖4 16μm 長度的λ-DNA的拉伸測量 (a)磁球通過 λ-DNA和側(cè)壁連接的示意圖;(b)DNA的拉伸曲線;(c)蠕蟲鏈(WLC)模型的擬合Fig.4. Stretching test of a 16 μm λ-DNA:(a)Schematic diagram of a 16 μm λ-DNA between the bead and the lateral surface;(b)stretching curve of DNA;(c) fitting of the worm like chain(WLC)model.

用蠕蟲鏈模型的(3)式對DNA的受力和首末端距進行擬合.公式中有一項是磁力F,DNA受到的磁力計算公式為[33]

其中?δy2是磁球在垂直于力的Y方向上振動方差的平均值.

經(jīng)(4)式計算,磁球在第1個位置的磁力是27 pN,已經(jīng)超過了蠕蟲鏈模型的適用范圍10 pN[26].而磁球在第11個位置已經(jīng)接觸到樣品槽側(cè)壁表面,導(dǎo)致測量的力F不準確.用剩下的9組數(shù)據(jù)用蠕蟲鏈模型對DNA的受力和首末端距進行擬合.擬合結(jié)果如圖4(c)所示,擬合優(yōu)度是99.94%,擬和得出在PBS緩沖液的條件下,雙鏈DNA的駐留長度A是(47±2)nm,與文獻上得到的結(jié)果一致[34].

3.4 對比不同儀器和條件下的噪聲

由于片層光照明的橫向磁鑷能夠直接追蹤吸附到毛細管側(cè)壁上的磁球或者用較短的DNA,RNA或蛋白質(zhì)連接的磁球,所以根據(jù)(3)式可知,其追蹤噪聲應(yīng)該更小.

圖5(a)展示了在1 pN條件下的追蹤噪聲.對于0.5μm長的dsDNA來講,片層光照明的橫向磁鑷測得的噪聲是19 nm,是用新型或傳統(tǒng)橫向磁鑷追蹤16μm 的λ-DNA噪聲(100 nm)的1/5.這說明短DNA的連接確實提高了精度.此外,我們也用自己搭建的縱向磁鑷測量了0.5μm長dsDNA在1 pN條件下的追蹤噪聲,為20 nm,和片層光照明的橫向磁鑷沒有明顯區(qū)別.這說明在小力條件下,片層光照明的橫向磁鑷和縱向磁鑷對短DNA的測量精度相近,普通磁鑷由于不能測量短DNA,因此精度大打折扣.

而在12 pN的大力條件下的測量結(jié)果如圖5(b)所示.片層光照明的橫向磁鑷對0.5μm的較短dsDNA測得的噪聲略微減小,變?yōu)?5 nm;新型或傳統(tǒng)橫向磁鑷對16μm長的λ-DNA測得的噪聲也明顯變小,都變?yōu)榇蠹s30 nm.二者相比,短DNA的連接仍然可以提高橫向磁鑷的精度.另一方面,用縱向磁鑷在12 pN拉伸0.5μm的dsDNA測得的噪聲也明顯減小,變?yōu)? nm.所以在大力條件下,片層光照明的橫向磁鑷精度比縱向磁鑷稍差.當然,縱向磁鑷所用物鏡的放大倍數(shù)是100×,NA值為1.49,而片層光照明的橫向磁鑷用的物鏡放大倍數(shù)是40×,NA值為0.6,精度比縱向磁鑷稍差是可以理解的.另一方面,這也說明片層光照明的橫向磁鑷還有提升空間,比如把40×的物鏡改為更大的放大倍數(shù),在大力條件下用其他直徑的磁球或者改進追蹤磁球的算法等.

綜上所述:片層光照明的橫向磁鑷能夠追蹤連接短DNA的磁球,從而明顯提高了傳統(tǒng)橫向磁鑷的精度,在小力和大力條件下都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)橫向磁鑷;和縱向磁鑷相比,片層光照明的橫向磁鑷在小力下精度與之相近,而在大力條件下比縱向磁鑷稍差.

圖5 橫向或縱向磁鑷測量不同長度的dsDNA在小力和大力下的噪聲 (a)在1 pN條件下的噪聲;(b)在12 pN條件下的噪聲Fig.5.Noise of short and long dsDNA at weak or strong force with transverse magnetic tweezers and longitudinal magnetic tweezers:(a)Noise at 1 pN;(b)noise at 12 pN.

4 結(jié) 論

傳統(tǒng)橫向磁鑷相比縱向磁鑷的一個重要優(yōu)點是更加簡單,成本更低.但是橫向磁鑷的缺點是空間精度比較差,這主要是因為樣品池的側(cè)壁在成像時形成的陰影會對離它較近的磁球影像產(chǎn)生干擾,因而普通橫向磁鑷只能測量連接長DNA的磁球的位置信息.本文介紹了一種片層光照明的橫向磁鑷.由于這種片層光照明的橫向磁鑷可以直接觀察吸附在樣品槽側(cè)壁的磁球,所以它可以追蹤短的DNA,RNA或蛋白質(zhì),拓展了橫向磁鑷的應(yīng)用范圍.同時,改進的簡單橫向磁鑷在小力條件下精度明顯提高到和復(fù)雜的縱向磁鑷相接近,大力下精度相差不大.所以這種簡便的橫向磁鑷可以一定程度上替代昂貴的縱向磁鑷.本文發(fā)展的片層光照明的橫向磁鑷在大力下的精度相對于縱向磁鑷還有差距,這是我們進一步改進的方向.