馬麗 賀小龍 李明 胡書新?

1)(中國科學(xué)院物理研究所,北京凝聚態(tài)物理國家研究中心,軟物質(zhì)物理重點實驗室,北京 100190)2)(中國科學(xué)院大學(xué)物理科學(xué)學(xué)院,北京 100049)3)(中國科學(xué)院生物物理研究所,生物大分子國家重點實驗室,北京 100101)

(2018年1月15日收到;2018年4月9日收到修改稿)

Bid蛋白是僅有BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族蛋白,在溶酶體膜透化以及線粒體外膜透化引發(fā)的細胞凋亡過程中起著非常重要的調(diào)控作用,但是Bid蛋白與生物膜之間的相互作用導(dǎo)致脂膜透化的確切機制尚不十分清楚.本文利用激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)及基于氧化石墨烯表面誘導(dǎo)熒光衰逝的單分子熒光技術(shù),分別從單囊泡及單分子水平對tBid蛋白與磷脂膜之間的相互作用進行了系統(tǒng)的研究.結(jié)果表明,tBid蛋白在膜上聚集后可引起脂膜的透化,且脂膜透化的發(fā)生源于聚集體中一些tBid蛋白更深入地插入了脂膜中.

1 引 言

細胞凋亡是多細胞生物體為保證機體健康發(fā)展,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,清除體內(nèi)多余物質(zhì)及危險細胞,由基因控制的細胞程序性死亡,是生物體為更好地適應(yīng)環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程[1,2].在細胞凋亡的線粒體凋亡路徑中,B-cell lymphoma protein-2(Bcl-2)家族蛋白通過蛋白-蛋白間以及蛋白-生物膜間相互作用充當著凋亡過程的中心調(diào)控者[3,4].根據(jù)Bcl-2家族蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,Bcl-2家族成員可以分為三大類,即抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白以及BH3-only蛋白.以Bcl-XL,Bcl-2以及Mcl-1為代表的抗凋亡蛋白,包含有完整的BH1,BH2,BH3,BH4四個保守結(jié)構(gòu)域,通過抑制促凋亡蛋白來促使細胞繼續(xù)存活[5].促凋亡蛋白,包括Bax,Bak等蛋白,包含了BH1,BH2,BH3三個結(jié)構(gòu)域,被認為可直接導(dǎo)致線粒體外膜透化.BH3-only蛋白僅含有一個BH3結(jié)構(gòu)域,包括tBid,Bad,PumaUMA,NoxaOXA等蛋白.這類蛋白可以響應(yīng)紫外輻射、DNA損傷、生長因子缺失等多種細胞內(nèi)凋亡刺激,激活Bax,Bak等蛋白從而引發(fā)下游級聯(lián)反應(yīng),其中不同的BH3-only蛋白對刺激的響應(yīng)不盡相同[6?8].Bid是BH3-interacting domain death agonist的簡稱,在一些細胞中,它是細胞凋亡內(nèi)源路徑和外源路徑的聯(lián)系紐帶[9,10].在細胞凋亡過程中,被激活的凋亡酶Caspase-8將Bid剪切為N-端和C-端兩個片段,成為cleaved Bid(cBid).此時cBid的兩部分仍依賴親疏水相互作用吸附在一起,當其由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體外膜時[11],兩個片段迅速分開,含有N-端的前兩個α螺旋p7飛走,而含有C-端的后六個α螺旋(tBid蛋白)p15結(jié)合在脂膜表面,并進一步引起依賴Bax,Bak等蛋白的線粒體外膜透化,導(dǎo)致細胞色素C以及其他凋亡因子從線粒體中釋放[3,4,11?17],而最終細胞走向死亡還是存活則取決于膜上Bcl-2家族中促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的相對水平與活動情況[8,18,19].在溶酶體膜的透化引發(fā)的細胞凋亡,如TNF-α誘導(dǎo)的肝細胞凋亡中,tBid蛋白也被證明是不可或缺的調(diào)控者[20].tBid蛋白對細胞凋亡的調(diào)控過程均發(fā)生在細胞器膜上,因而研究tBid蛋白與磷脂膜之間的相互作用對闡明細胞凋亡的分子機制具有非常重要的意義.雖然前人已經(jīng)進行了大量的研究,但是tBid蛋白與磷脂膜作用是否可以造成磷脂膜的透化仍存在較大爭議.1999年,Schendel等[21]通過膜片鉗技術(shù)指出tBid蛋白具備在膜上形成某種通道的能力(tBid蛋白濃度較高,為2.72μM(1 M=1 mol/L)).2002年,Grinberg等[22]也以輔助方法,在Bax蛋白存在的情況下使tBid蛋白寡聚于線粒體外膜,并進一步導(dǎo)致細胞色素C的泄露.Zhao等[23]以細胞實驗及體外實驗直接指出微摩爾級的tBid蛋白可以引發(fā)溶酶體膜的透化成孔,但是成孔機制不明確[23].對tBid蛋白進行了廣泛研究的Andrews等[3,11,24]認為tBid蛋白雖然在很多方面與Bax蛋白極為相似,可在磷脂膜上形成聚集體,但該聚集體不足以形成可使分子通透的孔道(使用的tBid蛋白濃度為納摩爾級).Bleichen等[25]亦認為雖然tBid蛋白與磷脂膜作用時可引起并進一步穩(wěn)定膜的彎曲結(jié)構(gòu),然而tBid蛋白自身在較低濃度條件下(tBid蛋白濃度為10 nM)并不能引起脂膜的透化,從而使細胞色素C自由通過.

為了確定tBid蛋白自身是否可以在較低濃度條件下引發(fā)磷脂膜的透化,我們采用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)及基于氧化石墨烯(graphene oxide,GO)表面誘導(dǎo)熒光衰逝的單分子熒光技術(shù)對tBid蛋白與磷脂膜的相互作用進行了系統(tǒng)的研究.激光掃描共聚焦顯微技術(shù)用激光作為光源,采用共軛聚焦原理和裝置,可以實現(xiàn)多激光多通道同時掃描、同時探測,對樣品進行成像.利用熒光標記探針,可以在亞細胞水平對tBid蛋白與磷脂膜的相互作用進行研究.而利用基于GO的表面誘導(dǎo)衰逝技術(shù),即單分子表面誘導(dǎo)熒光衰逝技術(shù)(single molecule surface induced fluorescence attenuation,sm-SIFA)則可以在分子水平展示tBid蛋白與磷脂膜作用的過程.sm-SIFA技術(shù)是利用薄膜介質(zhì)引起的表面熒光衰逝效應(yīng)(SIFA)發(fā)展的一種新的單分子熒光探測技術(shù)[26].當熒光探針靠近金屬或介質(zhì)膜表面時,熒光淬滅效應(yīng)會隨著距離的變化而發(fā)生顯著的變化,實驗得到的熒光強度變化是熒光分子相對于介質(zhì)表面的距離變化引起的,這使得我們在獲得單個膜蛋白在平行于膜表面運動(通過單分子定位技術(shù))的同時,還能獲得垂直于脂膜表面的單分子運動軌跡.以單層GO為吸收體,sm-SIFA技術(shù)的縱向空間分辨率可以達到0.6 nm,而脂雙層的總厚度一般只有約4 nm,因此利用sm-SIFA技術(shù)研究跨膜蛋白與脂膜之間的相互作用具有很大的優(yōu)勢.

2 實驗方法與材料

2.1 實驗原理

以單層GO作淬滅劑,當熒光分子靠近GO表面時,由于SIFA效應(yīng),熒光分子的熒光強度I滿足I/I0=(d/d0)4/[1+(d/d0)4][27,28],其中I0為單個熒光分子遠離GO時的強度,d0(約4 nm)為熒光分子在GO表面的衰減常數(shù),d為待測熒光分子與GO的距離.將磷脂膜組裝到修飾有聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)的GO表面,當單個熒光分子在磷脂膜內(nèi)運動時,其縱向入膜深度可以通過熒光強度來測量,分辨率可達亞納米級[26].

同時,由于實驗中使用熒光標記的蛋白分子標記率為100%,可以通過分析實驗結(jié)果得出tBid蛋白形成聚集體中的分子個數(shù).首先,石英玻璃上單個熒光分子的光強穩(wěn)定,可以以聚集體的總光強除以單個熒光分子的平均光強得到tBid蛋白聚集體的個數(shù);其次,在GO表面,聚集體的個數(shù)需要通過分子的分步淬滅曲線分析得到.熒光分子在脂膜中的位置(離開氧化石墨的距離)可以通過公式I/I0=(d/d0)4/[1+(d/d0)4]計算得到.其中d為熒光分子離開GO的距離.

2.2 實驗材料與方法

2.2.1 實驗材料

實驗中所用的所有磷脂、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二油酰磷脂酸(DOPA)以及二油酰磷脂酰-N-磺化麗絲胺羅丹明的銨鹽(Rh-PE)均購于Avanti Polar Lipids公司;HEPES,5-(6)-羧基熒光素、NHS-PEG(分子量5000)、四甲基羅丹明、膨脹石墨以及實驗中用到的各種有機溶劑均購于西格瑪奧德里奇公司.實驗用水為Milli-Q(Millipore)超純水(電阻率為18.2 M?·cm).

2.2.2 Giant unilamellar vesicles(GUVs)的制備

利用振蕩電場方法制備GUVs.ITO電極的處理:先用無水乙醇超聲10 min,再用氯仿／甲醇(體積比1:1)溶液超聲10 min,最后用甲醇淋洗并氮氣吹干,置于30?C真空干燥箱中干燥120 min后備用.用氯仿作為溶劑,配制1 mg/mL磷脂成膜液,并將其均勻地分散鋪展在處理好的ITO電極上,置于真空干燥箱干燥30 min.制備GUVs時,先向反應(yīng)艙室注入0.3 mol/L的蔗糖溶液適量,然后施加10 Hz,2.3 V的交變電場,在室溫下作用2 h后,緩慢降為2 Hz,2.3 V繼續(xù)作用30 min;最后電壓降至0 V后吸出制備好的GUVs溶液,以備使用.實驗時,取適量該GUVs溶液與適量溶于HEPES緩沖液的5-(6)-羧基熒光素(最終濃度為20μM),tBid蛋白(終濃度20 nM)共同混合.實驗中所用tBid蛋白均由合作者中國科學(xué)院生物物理研究所楊福愉研究組提供.

2.2.3 Small unilamellar vesicles(SUVs)的制備

將DOPC及DOPA以摩爾比4:1溶于適量的氯仿甲醇混合溶液中,混合均勻后用氮氣吹干,然后置于真空塔中抽真空處理1 h以上,以保證除去殘留的溶劑.以緩沖液進行水合,得到濃度約2 mg/mL的多層囊泡,靜置1 h后,超聲處理以獲得透亮的磷脂小囊泡溶液,于4?C條件下保存.實驗中均采用囊泡破裂法制備平面支撐磷脂雙層膜,即取該溶液200μL緩慢注入樣品池,并將樣品池置于37?C恒溫箱中過夜.實驗前使用2 mL緩沖液沖洗,以除去多余的囊泡.

2.2.4 GO-聚乙二醇-磷脂雙分子層的制備

采用改進的Hummer方法制備得到大片的單層GO[29,30],并利用Langmuir-Blodgett(LB)技術(shù)將大片單層GO轉(zhuǎn)移至清洗干凈的石英載玻片表面,經(jīng)85?C真空干燥2 h后,用雙面膠將其與蓋玻片黏合在一起,制備樣品池,并用硅膠對樣品池四周進一步密封.

配制濃度為0.2 mM氨基吡與2 mM NHSPEG的混合水溶液,以300 r/min在搖床上震動搖勻2 h,使二者充分反應(yīng).取反應(yīng)后的氨基吡-NHS-PEG水溶液200μL緩慢注入樣品池,氨基吡的芳香基團與GO之間的π-π相互作用可以將PEG分子錨定在GO的表面.孵育3 h后,再用2 mL二次去離子水沖洗樣品池,以除去未與GO表面連接的多余物質(zhì).灌注400μL緩沖液(20 mM Hepes,100 mM NaCl,pH=7.4)待用.

本實驗體系使用囊泡破裂法在修飾有PEG的GO表面構(gòu)筑平面支撐磷脂雙層膜.

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 tBid蛋白在GUVs及平面支撐膜表面具有很好的吸附性實驗材料

Zhao等[23]在研究tBid蛋白與類溶酶體膜之間的相互作用時發(fā)現(xiàn),溶酶體膜富含酸性磷脂,tBid蛋白會插入含有酸性磷脂的單層膜中,并在酸性磷脂的環(huán)境發(fā)生分子構(gòu)象的改變,形成寡聚體,繼而引起脂質(zhì)體內(nèi)容物的釋放,但其精確機制并未得到闡釋.我們選擇DOPA:DOPC=1:4富含磷脂酸的雙組分磷脂膜為模型膜體系,進行tBid蛋白與磷脂膜之間相互作用的研究.首先對tBid蛋白分子與囊泡及平面支撐單層膜兩種模型膜體系之間的吸附作用進行研究.激光掃描共聚焦顯微鏡可以通過多通道同時掃描同時成像的方式對tBid蛋白分子與囊泡之間的吸附作用進行直觀成像.將制備好的GUVs與熒光探針5-(6)-羧基熒光素溶液混合后,使用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀測.結(jié)果顯示,488 nm激光激發(fā)的通道GUVs外部綠色熒光信號很強,表明溶液中充滿了發(fā)綠光的5-(6)-羧基熒光素,而GUVs內(nèi)部無熒光信號,561 nm激光激發(fā)的通道無信號,表明囊泡此時具有非常好的完整性.加入四甲基羅丹明標記的tBid蛋白后,發(fā)現(xiàn)561 nm激光激發(fā)的通道中可見明顯的紅色熒光信號(圖1(a)).此時GUVs內(nèi)部仍無熒光信號,表明tBid蛋白可迅速吸附在GUVs表面,在極短的時間內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)仍舊保持非常好的完整性,沒有出現(xiàn)變形和泄漏.

平面支撐膜體系是另外一種常用的用于研究膜蛋白與脂膜之間相互作用的典型模型體系[24].利用囊泡破裂法直接在干凈的石英片表面生長磷脂雙分子層,再緩慢灌入20 nM熒光標記的tBid蛋白溶液,即可得到如圖1(b)所示的熒光成像,結(jié)果表明tBid蛋白在平面支撐膜體系中具有很好的吸附性.同時,可以觀察到tBid蛋白吸附到脂膜表面后有明顯的擴散運動,如圖1(c)所示,表明所使用的平面支撐膜具有較好的流動性,是非常適用于研究膜蛋白與磷脂膜間相互作用的模型系統(tǒng).得到的典型單分子熒光實驗結(jié)果如圖1(d)所示,熒光分子的淬滅為一步淬滅,表明吸附在脂膜表面的tBid蛋白分子是以單體的形式存在的.

圖1 tBid蛋白在脂膜表面的吸附 (a)tBid蛋白在囊泡表面的吸附結(jié)果;上排(體系中沒有tBid蛋白存在)從左至右分別是488 nm激光激發(fā)的通道,發(fā)綠光的5-(6)-羧基熒光素的成像結(jié)果;561 nm激光激發(fā)通道的成像結(jié)果;各通道成像結(jié)果的合成;下排(與tBid蛋白一起孵育的結(jié)果)從左至右分別是488 nm激光激發(fā)的通道,發(fā)綠光的5-(6)-羧基熒光素的成像結(jié)果;561 nm激光激發(fā)的通道,發(fā)紅光的4-甲基羅丹明的成像結(jié)果,各通道成像結(jié)果的合成;(b)tBid蛋白在平面支撐膜表面吸附的單分子熒光成像結(jié)果;(c)兩個tBid蛋白分子在平面支撐膜表面的運動軌跡;(d)平面支撐膜表面單個tBid蛋白分子一步淬滅的單分子熒光實驗結(jié)果Fig.1.Adhesion of tBids on membrane.(a)Adhesion of tBids on GUVs surface;upper(without tBid): fluorescence images of 5-(6)-carboxy fluorescein excited by 488 nm laser(left),excited by 532 nm laser(middle)and merged image(right).Lower(incubated with tBid): fluorescence images of 5-(6)-carboxy fluorescein excited by 488 nm laser(left),tetramethylrhodamine excited by 532 nm laser(middle)and merged image(right).(b)Adhesion of tBids on solid supported bilayers surface.(c)Typical traces of two tBid molecules moved on a solid-supported bilayer.(d)Arepresentative trace of fluorescence labelled tBid incubated with solid-supported bilayer.

3.2 tBid蛋白膜上累積致磷脂膜透化

根據(jù)已有的研究工作推測,在tBid蛋白與磷脂膜相互作用的過程中,當tBid蛋白自身濃度較低時,可能不會引起細胞器內(nèi)容物的泄露[25].本文從單囊泡和單分子水平對這個相互作用過程進行了系統(tǒng)研究.為了探索tBid蛋白與磷脂膜作用時GUVs形狀的變化,在制備GUVs時,摻入了0.001%的Rh-PE,此時囊泡的形狀在561 nm激光激發(fā)的紅光通道中可以被清晰地顯示出來.同時在GUVs體系中加入染料5-(6)-羧基熒光素,則溶液中充滿了發(fā)綠光的羧基熒光素分子.將野生型tBid蛋白灌入上述GUVs體系中,使其最終濃度為20 nM,并置于37?C恒溫箱中孵育.10 min后,囊泡的形態(tài)未見明顯變化(圖2(a)),即囊泡輪廓為球形,羧基熒光素存在于囊泡的外圍.這個結(jié)果表明,短時間內(nèi)低濃度的tBid蛋白與脂膜之間的相互作用無法導(dǎo)致囊泡上形成孔道.同時,使用單分子熒光技術(shù)對平面支撐膜體系中tBid蛋白與膜之間相互作用10 min后的結(jié)果進行了分析.如圖2(b)所示,與單體狀態(tài)時的圖1(b)相比較,此時蛋白的熒光強度及大小不再均一,出現(xiàn)了一些蛋白團簇.通過對熒光強度分析,可以得到團簇中tBid蛋白分子個數(shù)的分布狀態(tài),即團簇中的蛋白個數(shù)不一,但以單體、二聚體為主,出現(xiàn)了少量的三聚體、四聚體,偶爾可見五聚體及更大的聚集體(圖2(c)).上述結(jié)果表明,tBid蛋白分子在脂膜表面可緩慢聚集在一起,但在短時間內(nèi)不足以引起脂膜的透化,導(dǎo)致內(nèi)容物的泄露.

圖2 tBid蛋白在脂膜上的累積導(dǎo)致其內(nèi)容物泄露 (a)野生型tBid蛋白與含Rh-PE的囊泡孵育10 min后的實驗結(jié)果;從左至右分別是488 nm激光激發(fā)的通道,發(fā)綠光的5-(6)-羧基熒光素的成像結(jié)果;561 nm激光激發(fā)通道,發(fā)紅光羅丹明的成像結(jié)果;各通道成像結(jié)果的合成;(b)熒光標記的tBid蛋白與平面支撐膜孵育10 min后,在脂膜表面吸附的熒光成像結(jié)果;(c)熒光標記的tBid蛋白與平面支撐膜孵育10 min后團簇大小的統(tǒng)計結(jié)果;(d)野生型tBid蛋白與含Rh-PE囊泡孵育60 min后的實驗結(jié)果;從左至右分別是488 nm激光激發(fā)的通道,發(fā)綠光的5-(6)-羧基熒光素的成像結(jié)果;561 nm激光激發(fā)通道,發(fā)紅光羅丹明的成像結(jié)果;各通道成像結(jié)果的合成;(e)熒光標記的tBid蛋白與平面支撐膜孵育60 min后,在脂膜表面吸附的熒光成像結(jié)果;(f)熒光標記的tBid蛋白與平面支撐膜孵育60 min后團簇大小的統(tǒng)計結(jié)果Fig.2.Permeabilization with accumulation of tBid on Membrane.(a)Representative images of GUVs incubated with wild-type tBid for 10 min; fluorescence images of 5-(6)-carboxy fluorescein excited by 488 nm laser(left),rhodamine excited by 532 nm laser(middle)and merged image(right);(b)image of the fluorescence labelled tBid incubated with a solid-supported bilayer for 10 minutes;(c)probability distribution function(PDF)of the fluorescence labelled tBid cluster size for 10 minutes incubation with a solid-supported bilayer;(d)representative images of GUVs incubated with wild-type tBid for 60 min; fluorescence images of 5-(6)-carboxy fluorescein excited by 488 nm laser(left),rhodamine excited by 532 nm laser(middle)and merged image(right);(e)image of the fluorescence labelled tBid incubated with a solid-supported bilayer for 60 min;(f)probability distribution function(PDF)of the fluorescence labelled tBid cluster size for 60 min incubation with a solid-supported bilayer.

延長tBid蛋白與GUVs及平面支撐膜體系的孵育時間至1 h,在不同體系中均看到了與之前不同的現(xiàn)象.在GUVs體系中,少量的囊泡內(nèi)部開始出現(xiàn)488 nm激光激發(fā)的綠色熒光信號,如圖2(d)中的箭頭所指.盡管囊泡內(nèi)熒光強度略低于囊泡外,但明顯已經(jīng)有5-(6)-羧基熒光素分子滲透進入了囊泡內(nèi)部,而此時561 nm激光激發(fā)通道顯示的囊泡依然保持原有的形狀.這表明,羧基熒光素由囊泡外部進入到囊泡內(nèi)部是由于tBid蛋白與GUVs之間的相互作用,導(dǎo)致囊泡形成通道發(fā)生了泄漏.在平面支撐膜體系中(圖2(e)),與圖2(b)相比較,tBid蛋白團簇變得更多更大了,統(tǒng)計結(jié)果顯示團簇中蛋白聚集體中蛋白分子的個數(shù)分布變寬、變大,峰值為9個分子(圖2(f)).上述結(jié)果表明,當tBid蛋白聚集到一定程度時,可在膜上形成某種通道,且通道大小足以使熒光分子自由通過.

圖3 (a)單分子表面誘導(dǎo)熒光衰逝技術(shù)(sm-SIFA)示意圖;(b)熒光標記在181位點單個tBid蛋白分子在石英表面和單層GO-PEG-bilayer體系中熒光光強實驗結(jié)果的對比;(c)tBid蛋白分子聚集狀態(tài)處于低聚集狀態(tài)時,熒光分布淬滅的實驗結(jié)果;(d)tBid蛋白分子聚集狀態(tài)處于高聚集狀態(tài)時,平面支撐膜表面tBid蛋白的單分子熒光實驗結(jié)果;(e)相應(yīng)于(d)中曲線的單層GO表面熒光分子的光強分布圖;(f)tBid蛋白分子聚集狀態(tài)處于高聚集狀態(tài)時,熒光分布淬滅的實驗結(jié)果;紅色臺階是處于脂膜表面熒光分子的淬滅,藍色是處于脂膜深處熒光分子的淬滅過程Fig.3. (a)Schematic diagram of single molecule surface-induced fluorescence attenuation(sm-SIFA);(b)comparison of the fluorescent intensity of 181 labelled tBid on a monolayered GO-PEG-supported bilayer(black)to that on a quartz-supported bilayer(grey);(c)photobleaching results of 181 labelled tBid incubated with GO-PEG-supported bilayer for a few minutes;(d)a fluorescence trace of 181 labelled tBid incubated with GO-PEG-supported bilayer for a long time;(e)probability distribution function(PDF)of the fluorescent intensity built from trace in curve(d);(f)photobleaching results of 181 labelled tBid incubated with GO-PEG-supported bilayer for a long time;red step is ascribed to the photobleach of the fluorescence on the membrane surface,and blue step is ascribed to the photobleach of the fluorescence inserted deeply into the membrane.

3.3 聚集體中tBid蛋白可深入插入膜中

為了探索tBid蛋白聚集體引起磷脂膜透化的分子機制,我們利用新發(fā)展的sm-SIFA研究了tBid蛋白與磷脂膜相互作用時tBid蛋白構(gòu)型的變化,該技術(shù)優(yōu)勢在于能以亞納米精度實時測量單個熒光分子在脂膜內(nèi)的位置.如圖3(a)所示,選用GOPEG的平面支撐膜體系,通過測量單個熒光分子熒光強度的變化來測定熒光分子距離GO表面的距離,PEG分子層的厚度為1nm,磷脂雙分子層的厚度為4 nm,根據(jù)公式I/I0=(d/d0)4/[1+(d/d0)4],可以精確地測量出所標記位點在磷脂膜中的縱向位置.

實驗中,181殘基上標記了熒光分子的tBid蛋白分子剛吸附在脂膜表面上時,熒光強度均一,表現(xiàn)為典型的單分子熒光曲線(圖3(b)).單個tBid蛋白分子在單層GO體系中光強約為石英表面熒光強度的70%,根據(jù)計算,對于tBid蛋白單體而言,此時181位點位于膜表面的位置,與前人的核磁共振結(jié)果以及電子順磁共振結(jié)果相一致,顯示了我們所使用的單分子方法的可靠性[31,32].將tBid蛋白與脂膜一起孵育,由于實驗中所用蛋白分子的熒光標記率約為100%,通過分析分子分步淬滅曲線中臺階的個數(shù),可以得到聚集體中的分子個數(shù).如圖3(c)所示,當tBid蛋白聚集體個數(shù)為3時,每個熒光分子光強仍舊較為接近,約為70%I0,表明在三聚體中181位點仍位于脂膜表面.延長孵育時間,實驗結(jié)果中出現(xiàn)了如圖3(d)中所示的典型實驗曲線,表明單分子熒光信號出現(xiàn)了不穩(wěn)定性,熒光強度的漲落較大.對該單層GO體系中熒光分子的光強信息進行統(tǒng)計,可以看出有明顯的三態(tài)分布(圖3(e)).除了小于石英表面熒光強度20%的背景信號以及位于脂膜表面的熒光強度約為70%I0的熒光信號外,還出現(xiàn)了熒光強度更弱一點的信號,其熒光強度約為35%I0.此時,tBid蛋白聚集體個數(shù)為4,甚至更大.分步淬滅的單分子熒光曲線如圖3(f)所示,除了熒光強度為70%I0的淬滅臺階外(圖3(f)中的紅色臺階),還出現(xiàn)了熒光強度為35%I0的淬滅臺階(圖3(f)中的藍色臺階),此臺階的出現(xiàn)說明181位點進入到了脂膜表面以下更深一些的位置,即距離脂膜上表面(1.5±0.4)nm處.上述結(jié)果綜合表明,在這種聚集狀態(tài)中,181位點可以從脂膜的表面進入到膜中較深的位置;同時,對于聚集體而言,并不是每個蛋白的181位點都位于膜中同一深度,它們的入膜深度有深有淺,表明聚集體中每個蛋白構(gòu)象并不一致.

上述結(jié)果表明,聚集體中tBid蛋白深入脂膜是引起磷脂膜透化的分子機制.因為只有當tBid蛋白聚集到一定程度時,磷脂膜才能透化,而tBid蛋白也只有在聚集到一定個數(shù)時,才會出現(xiàn)入膜較深的狀態(tài).tBid蛋白可深入脂膜是引起膜透化的必要條件,盡管在透化時聚集體中蛋白構(gòu)象不一,但不是每一個蛋白都入膜很深.

4 結(jié) 論

通過GUVs和平面支撐膜體系分別從單囊泡水平和單分子水平研究了tBid蛋白與脂膜之間的相互作用,兩種體系以互為補充的方式提供了同一條件下不同尺度的信息.實驗結(jié)果明確了tBid蛋白與磷脂膜作用時可引起膜的透化,使得熒光分子可以自由通過.磷脂膜透化的發(fā)生由tBid蛋白在磷脂膜上逐步形成聚集體引起,其分子機制為聚集體中某些tBid蛋白的一些區(qū)域可以深入至膜中較深位置,且聚集體中蛋白構(gòu)象不一致.結(jié)果展示了單囊泡、單分子水平實驗相結(jié)合的優(yōu)勢,并且直接從單分子水平指出tBid蛋白引起膜透化的分子機制,同時體現(xiàn)了SIFA技術(shù)的優(yōu)越性.