付巖，王全勝，張亮，朱勇，趙健，吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

啶氧菌酯是一種廣譜、內(nèi)吸性的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其作用機(jī)制是通過在細(xì)胞色素b和c1間電子轉(zhuǎn)移抑制線粒體的呼吸[1-2]。廣泛應(yīng)用于水稻、花生、黃瓜、葡萄等作物[3]，主要用于防治葉面病害如葉枯病、葉銹病、穎枯病、褐斑病、白粉病等[4]。

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生草本植物，具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用，目前浙江省的石斛產(chǎn)業(yè)化基地已超過100個(gè)，種植面積近2 000 hm2，產(chǎn)值27億元[5-6]。隨著鐵皮石斛的人工栽培和大規(guī)模種植，病蟲害問題日益突出。據(jù)報(bào)道，鐵皮石斛主要病害有軟腐病、炭疽病，疫病，葉銹病等，在生產(chǎn)栽培中啶氧菌酯被用來防治葉銹病[7]。雖然啶氧菌酯毒性不大，但若使用不當(dāng)造成殘留超標(biāo)，會對消費(fèi)者的健康產(chǎn)生危害[8]。我國尚未制定啶氧菌酯在鐵皮石斛中的最大殘留限量(MRL)，歐盟規(guī)定了啶氧菌酯在草本植物中的最大殘留限量為0.01 mg·kg-1[9]。目前已有對鐵皮石斛中有機(jī)磷、菊酯類、三唑類等農(nóng)藥殘留檢測的相關(guān)報(bào)道[10-16]，但是鐵皮石斛中啶氧菌酯殘留量的測定方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用改良的QuEChERS前處理方法，電噴霧正離子反應(yīng)監(jiān)測模式監(jiān)測，建立了準(zhǔn)確、靈敏和快速的鐵皮石斛中啶氧菌酯UPLC-MS/MS分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters Xevo TQ MS超高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)及Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；KS4000ic恒溫振蕩器(德國IKA 公司)；3K15高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；GENIUS3旋渦混合器(德國IKA 公司)；萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 試劑與材料

啶氧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品(99%，德國Dr.Ehrensorfer公司)。乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；PSA(40～60 μm，上海安譜公司)，無水硫酸鎂和氯化鈉均為分析純，試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.3 樣品前處理

稱取鐵皮石斛樣品5 g置于50 mL離心管中，加入10.0 mL純凈水浸泡20 min后，加入15.0 mL乙腈，以350 r·min-1振蕩提取30 min，加入 1.5 g氯化鈉和4.0 g硫酸鎂劇烈震蕩1 min，再以9 500 r·min-1離心3 min，取2 mL上清液于5 mL離心管中，加入100 mg PSA和300 mg硫酸鎂，漩渦1 min，9 500 r·min-1離心3 min。吸取凈化上清液0.40 mL至另一試管中并加入0.60 mL 0.1%甲酸溶液混合均勻，過0.22 μm濾膜后供UPLC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

色譜柱：Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫條件：B相在0.5 min內(nèi)保持40%后，在1.0 min內(nèi)線性增至80%，保持2.0 min，然后在0.1 min內(nèi)降至40%，保持2.0 min；流速0.30 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。ESI源正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，毛細(xì)管電壓2.5 kV，萃取錐孔電壓20 V，RF透鏡電壓0.5 V，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，錐孔氣流速50 L·h-1，脫溶劑氣流速1 000 L·h-1，錐孔電壓為14 V；啶氧菌酯定量離子對為368.10>204.96，碰撞電壓為8 eV；定性離子對為368.10>144.87，碰撞電壓為14 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇ESI+離子模式。為優(yōu)化質(zhì)譜條件，配制啶氧菌酯100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用該標(biāo)準(zhǔn)溶液在全掃描方式下，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、裂解溫度、脫溶劑氣流速等參數(shù)，得到待測物最強(qiáng)的分子離子峰。然后在以上的質(zhì)譜條件下，對選定的母離子進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)。再經(jīng)儀器自帶Intellistart軟件優(yōu)化和空白樣品測定后確定啶氧菌酯的定量離子對為368.10/204.96，定性離子對為368.10/144.87。

2.2 流動相的選擇

經(jīng)過色譜條件試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇乙腈為有機(jī)相時(shí)，同樣梯度洗脫條件下出峰時(shí)間比甲醇為有機(jī)相時(shí)更快；水相中加入0.1%甲酸后，響應(yīng)更高，峰型更好。因此，最終確定流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脫，流速為0.3 mL·min-1。此時(shí)分析時(shí)間較短，峰型較好，出峰時(shí)間為3.0 min，保留時(shí)間適中。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取啶氧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g(精確至0.1 mg)于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)母液。采用基質(zhì)外標(biāo)法定量。將100 mg·L-1的啶氧菌酯標(biāo)準(zhǔn)母液用鐵皮石斛空白基質(zhì)提取液稀釋配制成0.10、0.05、0.01、0.005、0.001 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液溶液。按1.4條件進(jìn)行測定。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。分析結(jié)果表明，啶氧菌酯在0.001～0.1 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=93 529 743x+97 188，R2=0.998。

圖1 鐵皮石斛空白基質(zhì)中啶氧菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

通過3倍信噪比(S/N)計(jì)算得出方法的檢出限為1×10-13g，靈敏度較高。取鐵皮石斛的空白樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，添加啶氧菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加水平分別為0.005、0.01、0.50、5.0 mg·kg-1，按前述前處理步驟進(jìn)行處理，每濃度處理重復(fù)5次，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。如表1所示，啶氧菌酯在鐵皮石斛中平均添加回收率為83.3%～88.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～9.1%。說明該方法準(zhǔn)確度和精密度均較好，符合農(nóng)藥殘留分析的要求[17]。

表1 啶氧菌酯在鐵皮石斛中的添加回收率

3 小結(jié)與討論

目前，關(guān)于啶氧菌酯殘留分析方法的研究報(bào)道較少，主要有超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法[2]、液相色譜法[8]、氣相色譜法[18]等。胡秀卿等[2]使用乙腈提取葡萄和土壤中的啶氧菌酯，HLB小柱凈化，UPLC-MS/MS測定，結(jié)果表明，儀器的最小檢出量(LOD)為4×10-13g，最低檢出濃度(LOQ)為0.01 mg·kg-1。孫揚(yáng)等[8]采用液相色譜分析方法研究了啶氧菌酯在黃瓜中的殘留，LOQ為0.02 mg·kg-1。段麗芳等[18]采用氣相色譜分析方法研究了啶氧菌酯在西瓜和土壤中的殘留，LOD為1×10-11g，LOQ為0.01 mg·kg-1。

本文所建立的方法采用改良的QuEChERS法提取、PSA凈化，縮短了前處理時(shí)間。同時(shí)方法檢出限為1×10-13g，定量限為0.005 mg·kg-1，與已報(bào)道的方法相比，靈敏度和準(zhǔn)確度較高。本研究通過對色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了鐵皮石斛中啶氧菌酯殘留的UPLC-MS/MS方法，靈敏度、準(zhǔn)確度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求，可為中藥材鐵皮石斛中啶氧菌酯的檢測提供方法依據(jù)。