陳志，汪一婷，呂永平，牟豪杰

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310021)

美人蕉(Cannaindica) 原產(chǎn)美洲，別名蘭蕉、曇華，植株俊秀挺拔、花大色艷、花色豐富、花期長(zhǎng)，是一種非常優(yōu)良的園林和景觀綠化植物，且開花時(shí)正值我國(guó)南方炎熱少花的季節(jié)，可大大豐富園林綠化中的色彩。同時(shí)，美人蕉具有較強(qiáng)的凈化環(huán)境和抗污染的能力，對(duì)氟化物、二氧化硫等有毒氣體的吸收能力較強(qiáng)，是一種非常理想的多用途花卉。美人蕉通常利用地下根莖進(jìn)行分株繁殖，但會(huì)導(dǎo)致母本攜帶病毒不斷積累并傳播給后代，迄今已在美人蕉屬植物發(fā)現(xiàn)的病毒包括美人蕉黃色條紋病毒、西紅柿不育病毒[1]、美人蕉黃斑駁病毒[2-3]、黃瓜花葉病毒[4-5]、菜豆黃花葉病毒[4]等，引起植株葉片產(chǎn)生花斑或植株壞死，極大降低美人蕉的觀賞性。

關(guān)于美人蕉組織培養(yǎng)的報(bào)道中，劉麗萍等[6]以帶芽苞根莖為外植體進(jìn)行水生美人蕉組培快繁技術(shù)研究；王丹等[7]以大花美人蕉根莖莖尖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)技術(shù)研究中指出，美人蕉增殖效率低下，最高為1.67。本研究旨在建立美人蕉高效組培快繁體系，同時(shí)進(jìn)行美人蕉脫毒種苗生產(chǎn)研究，為美人蕉脫毒苗推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本單位引進(jìn)并種植保存的7個(gè)國(guó)外美人蕉品種。

1.2 方法

1.2.1 美人蕉無(wú)菌材料獲得

選取美人蕉地下帶芽的根莖作為起始材料，將根莖表面根切除，洗凈附著物，將芽從根莖上切下，剝除外部1～2 層芽鱗，表面處理光滑后即可進(jìn)行表面消毒。用洗潔精溶液振蕩清洗20 min，然后用流水沖洗干凈外植體表面殘留物，在超凈工作臺(tái)上將洗凈的外植體轉(zhuǎn)移至無(wú)菌錐形瓶中，浸入75%酒精60 s，再用有效氯濃度為1%的NaClO溶液浸泡10～15 min，然后用無(wú)菌水清洗經(jīng)過(guò)消毒處理的外植體4～5次，將外植體接種到MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度(40±2)μmol·m-2·s-1，光周期為16 h。

1.2.2 美人蕉莖尖培養(yǎng)

將株高2 cm左右美人蕉無(wú)菌萌發(fā)芽轉(zhuǎn)移至放有無(wú)菌濾紙的接種盤中，在解剖鏡下將芽鱗逐層剝離，最后切下頂端0.2～0.5 mm長(zhǎng)的莖尖部分，將其接種到MS+6-BA(0.10～0.50)mg·L-1+NAA(0.05～0.20)mg·L-1+脯氨酸(50～200)mg·L-1+蔗糖30 g·L-1的培養(yǎng)基中，(24±2)℃下暗培養(yǎng)7～10 d，然后將材料移至同溫下光培養(yǎng)(12～14)h·d-1，光照強(qiáng)度為(40±2)μmol·m-2·s-1，至莖尖培養(yǎng)材料長(zhǎng)至1～2 cm后進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)及增殖。

1.2.3 美人蕉不定芽誘導(dǎo)及增殖

在莖尖培養(yǎng)獲得的不定芽基部輕劃造成一些傷口，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)及增殖，將每個(gè)芽作為1個(gè)株系進(jìn)行編號(hào)，方便后期病毒檢測(cè)。不定芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA(6.0～10.0)mg·L-1+CaCl2(500～800)mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，培養(yǎng)溫度(24±2)℃，光照時(shí)間為(12～14)h·d-1，光照強(qiáng)度為(40±2)μmol·m-2·s-1。

1.2.4 美人蕉病毒檢測(cè)及脫毒材料擴(kuò)繁

每個(gè)株系美人蕉增殖良好材料剪取新鮮葉片100 mg左右進(jìn)行病毒檢測(cè)，本研究檢測(cè)病毒包括黃瓜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和西紅柿不育病毒共3種，采用雙抗體夾心ELISA(DAS)檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，所有ELISA試劑盒購(gòu)于ADGEN公司，操作流程詳見(jiàn)說(shuō)明書。對(duì)于未攜帶檢測(cè)病毒的株系，按照“1.2.3”方法進(jìn)行不定芽增殖擴(kuò)繁。

1.2.5 美人蕉生根誘導(dǎo)及移栽馴化

叢生不定芽從基部將生長(zhǎng)至3～5 cm高的不定芽單個(gè)分開，接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，培養(yǎng)溫度(24±2)℃，光照時(shí)間為(12～14)h·d-1，光照強(qiáng)度為(40±2)μmol·m-2·s-1。

不定芽基部長(zhǎng)出2～3條1～2 cm的不定根后移至溫室，散射光下培養(yǎng)5 d后打開瓶蓋，再培養(yǎng)1～2 d，將生根苗表面瓊脂洗干凈，栽入基質(zhì)中，相對(duì)濕度90%以上培養(yǎng)15 d，然后在溫室中正常培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 美人快繁體系建立

美人蕉快繁體系建立情況如圖1所示。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，美人蕉無(wú)菌材料極易成活、生根，而且在添加有植物生長(zhǎng)素或低濃度的6-BA的培養(yǎng)基中，美人蕉也極易生長(zhǎng)出不定根，從而導(dǎo)致增殖系數(shù)極低，難以達(dá)到產(chǎn)業(yè)要求。本研究發(fā)現(xiàn)，作為細(xì)胞分裂活性更強(qiáng)的細(xì)胞分裂素噻苯隆(TDZ)對(duì)美人蕉不定芽增殖效果不佳，即使在添加低濃度TDZ的培養(yǎng)基中，不定芽叢生、矮化、玻璃化現(xiàn)象仍很明顯，能獲得的有效不定芽數(shù)量有限，因此增殖效率提升有限。王丹等[7]研究報(bào)告中也得出與本研究相同結(jié)果。研究還發(fā)現(xiàn)，在增殖培養(yǎng)基中增加Ca2+可有效抑制不定根的數(shù)量。當(dāng)Ca2+離子濃度達(dá)到800 mg·L-1時(shí)，基本可抑制增殖過(guò)程中不定根的形成，不定芽增殖效率可提高至2.8左右，且長(zhǎng)勢(shì)正常。劉臻曄[8]的研究結(jié)果顯示，Ca2+離子的加入對(duì)馬鈴薯試管苗生根無(wú)影響或有部分促進(jìn)效果，與本研究結(jié)果相反，可能是由于不同植物造成的。

a為根莖外植體；b為不定芽增殖； c為不定芽生根；d為組培苗移栽圖1 美人蕉再生體系的建立

2.2 美人蕉莖尖培養(yǎng)

莖尖大小對(duì)培養(yǎng)的成活率影響很大。根據(jù)賢武等[9]的研究結(jié)果，對(duì)2 mm長(zhǎng)的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，莖尖成活率最低為12.5%，最高為65.0%。Ramgareeb等[10]研究結(jié)果也顯示，當(dāng)莖尖長(zhǎng)度介于1～2 mm時(shí)，成活率為79.2%；若小于1 mm，則成活率下降至46.0%；若培養(yǎng)莖尖尺寸更小，成活率將更低。但據(jù)Gosalvez-Bernal等[11]對(duì)康乃馨莖尖中病毒分布的研究結(jié)果顯示，僅在莖尖頂端分生組織0.5 mm以上區(qū)域內(nèi)未檢測(cè)到病毒粒子的存在，因此為了避免因脫毒不徹底造成的材料浪費(fèi)，本研究采用培養(yǎng)長(zhǎng)度低于0.5 mm(0.2～0.5 mm)的美人蕉莖尖培養(yǎng)。

研究對(duì)已建立無(wú)菌體系的7個(gè)美人蕉進(jìn)行莖尖剝離和培養(yǎng)，每個(gè)品種剝離30個(gè)莖尖，最終獲得71個(gè)成活材料。表1中，成活率為成活株系與起始莖尖數(shù)量的比值，莖尖培養(yǎng)成活率最高約為53.3%，最低約為13.3%，平均成活率約33.8%，基本與賢武等[12]研究結(jié)果符合。莖尖培養(yǎng)過(guò)程如圖2所示。

2.3 莖尖獲得材料病毒檢測(cè)情況

對(duì)本研究獲得的7個(gè)美人蕉品種共71個(gè)莖尖再生株系進(jìn)行黃瓜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和西紅柿不育病毒檢測(cè)。對(duì)第1次檢測(cè)結(jié)果中未攜帶3種檢測(cè)病毒的材料在接下來(lái)連續(xù)2個(gè)培養(yǎng)周期中重復(fù)檢測(cè)，將最終3次檢測(cè)均未攜帶檢測(cè)病毒的株系確定為脫毒植株。表1中，無(wú)毒植株得率為無(wú)毒株系與成活株系的比值，共獲得40個(gè)未攜帶3種檢測(cè)病毒株系，最高脫毒率為100.0%，最低脫毒率為30.8%，平均脫毒植株得率為56.3%。

表1 美人蕉莖尖培養(yǎng)及病毒檢測(cè)結(jié)果

圖2 美人蕉莖尖剝離及培養(yǎng)的情況

檢測(cè)株系中，攜帶TAV病毒植株最少，僅有2個(gè)品種4個(gè)株系攜帶；攜帶BYMV病毒植株系最多，有6個(gè)品種27個(gè)株系；攜帶CMV病毒植株系有4個(gè)品種11個(gè)株系。另外，檢測(cè)結(jié)果還顯示，美人蕉存在復(fù)合侵染的情況。本研究中，攜帶2種檢測(cè)病毒的有6株系，攜帶所有檢測(cè)病毒的植株有3株系。

3 討論

已有研究結(jié)果表明，美人蕉快繁體系中極低的不定芽增殖效率在很大程度上阻礙了利用植物組培技術(shù)對(duì)美人蕉品種的推廣應(yīng)用，本研究前期也遇到這個(gè)問(wèn)題，因此今后提高有效不定芽增殖效率是美人蕉快繁體系建立和優(yōu)化的重點(diǎn)方向。通過(guò)在增殖培養(yǎng)基中加入5～8 mmol·L-1的Ca2+后，有效抑制了增殖過(guò)程中不定根的形成，使不定芽增殖效率提高到2.8左右，而且對(duì)不定芽生長(zhǎng)及后期生根誘導(dǎo)無(wú)不良影響，這在美人蕉組培報(bào)道中尚屬首次。

本研究的另一重點(diǎn)是美人蕉脫毒材料的獲得。在美人蕉莖尖培養(yǎng)階段，并未以莖尖成活率為重點(diǎn)，而是以脫毒效率為重點(diǎn)，因此剝離莖尖尺寸基本小于0.5 mm，雖然平均成活率約為33.8%，但種苗脫毒率超過(guò)平均56.3%。賢武等[12]在甘蔗莖尖培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，1～2 mm甘蔗莖尖培養(yǎng)成活率達(dá)到60%～80%，遠(yuǎn)高于本研究結(jié)果，但其并未進(jìn)行病毒檢測(cè)相關(guān)方面工作，故脫毒效率未知。結(jié)合前人研究結(jié)果，本研究認(rèn)為，對(duì)于植物莖尖培養(yǎng)而言，其主要目的就是獲得脫毒植株，因此脫毒效率是首先必須要考慮的。

綜上所述，本研究建立美人蕉快繁技術(shù)體系增殖效率達(dá)到2.8，莖尖培養(yǎng)體系中莖尖成活率達(dá)到33.8%，脫毒株系得率約56.3%，基本達(dá)到美人蕉脫毒種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需求。