王嬌，齊沛沛，劉之煒，周莉，汪志威，王祥云，徐浩，狄珊珊，王強(qiáng)，王新全

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

農(nóng)藥的使用在葡萄生產(chǎn)中具有防治病蟲害、提升產(chǎn)量和改善產(chǎn)品品質(zhì)等重要作用，但隨之而來的農(nóng)藥殘留問題也使農(nóng)藥的使用備受爭議[1-2]。為了保證葡萄質(zhì)量安全，靈敏、準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)必不可少。目前，常用的葡萄中農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)有色譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[3-5]等方法。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)具有高靈敏度、高選擇性和高通量分析的優(yōu)勢，但普遍存在的基質(zhì)效應(yīng)卻對精準(zhǔn)定量存在影響。為了提高分析結(jié)果的精準(zhǔn)度，越來越多的研究致力于降低或消除基質(zhì)效應(yīng)[6-10]。因此，本研究針對葡萄中常用農(nóng)藥(含植物生長調(diào)節(jié)劑)，評價不同農(nóng)藥殘留樣品前處理技術(shù)，聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析不同種類葡萄樣品時藥物的基質(zhì)效應(yīng)差異。選用農(nóng)藥品種26種，包括殺蟲劑、三唑類殺菌劑和植物生長調(diào)劑，分別為啶蟲脒、吡蟲啉、噻蟲嗪、多菌靈、克百威、滅多威、咪鮮胺、嘧霉胺、除蟲脲、氟啶脲、苯醚甲環(huán)唑、多效唑、戊唑醇、腈菌唑、氟硅唑、丙環(huán)唑、戊菌唑、三唑醇、已唑醇、噻嗪酮、矮壯素、氯吡脲、1-萘乙酸、噻菌靈、烯酰嗎啉、炔螨特。選用色澤差異顯著的葡萄品種5種，分別為白羅莎里奧(淺)、陽光玫瑰(淺)、新雅(深)、新郁(深)及09-142(深)。分別選擇代表性檢測方法QuChERS和GB/T 20769—2008進(jìn)行樣品前處理和分析，以評價不同葡萄品種的基質(zhì)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

LC-30A超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；AB-SCIEX 4500三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB公司)；臺式離心機(jī)(美國Thermo公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；Filter Unit濾膜(0.22 μm)、Carb-NH2SPE柱(Agela Technologies公司)。氯化鈉、無水硫酸鎂等均為分析純；甲醇、乙腈、甲苯(色譜純，美國Merck 公司)；甲酸銨(HPLC級，美國Tedia公司)；商品化PSA、C18 (美國Agela Technologies公司)；實驗用水為超純水。26種農(nóng)藥分析標(biāo)準(zhǔn)品購于上海農(nóng)藥研究所或農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。

單標(biāo)儲備液。各分析標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解于甲醇中，各配置成一定濃度的單標(biāo)儲備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確移取一定量的單標(biāo)儲備液于25 mL容量瓶中，混勻，甲醇定容。

1.2 QuChERS方法的樣品前處理過程

稱取葡萄樣品(10.00±0.05) g于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，渦旋1 min，然后加入1.5 g NaCl和4 g無水MgSO4，渦旋1 min，在7 000 r·min-1條件下離心3 min，取上清液凈化。準(zhǔn)確移取乙腈萃取上清液1 mL加入到含有50 mg PSA、50 mg C18和0.15 g無水MgSO4離心管(2 mL)中，劇烈震蕩后渦旋1 min，在7 000 r·min-1條件下離心3 min。取0.5 mL上清液轉(zhuǎn)移至含有0.5 mL水的離心管(2 mL)中，混勻，過0.22 μm濾膜，待LC-MS/MS分析。

1.3 GB/T 20769—2008樣品前處理過程

稱取20 g葡萄樣品(精確至0.01 g)于200 mL稱量杯中，加入40 mL乙腈，用高速組織搗碎機(jī)在15 000 r·min-1，勻漿提取1 min，經(jīng)抽濾后，在濾液中加入5 g氯化鈉，靜置30 min，取上清液20 mL(相當(dāng)于10 g試樣量)，在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約1 mL，待凈化。

在Carb-NH2SPE柱中，加樣前先用4 mL乙腈+甲苯(3+1)預(yù)洗柱，當(dāng)液面到達(dá)無水硫酸鈉的頂部時，迅速將樣品濃縮液轉(zhuǎn)移至凈化柱上，并更換新平底燒瓶接收。再每次用2 mL乙腈+甲苯(3+1)洗滌樣液瓶3次，并將洗滌液移入柱中。在柱上加上50 mL貯液器，用25 mL乙腈+甲苯(3+1)洗脫農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品，合并于平底燒瓶中，并在35 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL，將濃縮液置于氮氣吹干儀上吹干，迅速加入1 mL的甲醇+水(1+1)，混勻，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，待LC-MS/MS分析。

1.4 LC-MS/MS分析方法

采用AB 4500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行葡萄中多農(nóng)藥殘留的分析測定。色譜柱為Inertsil ODS-3 (75 mm×2.1 mm，2 μm)，流動相為水和甲醇(1∶9，V∶V)，其中水相和有機(jī)相中均加入5 mmol·L-1甲酸銨。流速為0. 25 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件。采用電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，加熱溫度450 ℃，噴霧電壓為正源5 500 V，負(fù)源4 500 V。每個化合物由2對母離子-子離子對共同確定，各化合物的母離子-子離子對及相應(yīng)的碰撞能量和去簇電壓經(jīng)方法優(yōu)化后條件見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng)的評價方法

農(nóng)藥殘留檢測過程中基質(zhì)效應(yīng)是影響定量準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素之一，對待測物的準(zhǔn)確定量與定性造成影響。因此，在建立分析方法之前，須對待測物進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的評估，并采取有效措施進(jìn)行消除或補(bǔ)償，提高分析的可靠性。目前常用的基質(zhì)效應(yīng)的評價方法是采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的線性方程斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程斜率比(Slope ratio，SR)，可以采用SR比值或其百分?jǐn)?shù)表示。若SR=100%(或1)，說明無基質(zhì)效應(yīng)；若SR<100%，呈基質(zhì)抑制效應(yīng)；若SR>100%，呈基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。當(dāng)SR為80%～120%時，存在基質(zhì)效應(yīng)，但影響不大；當(dāng)50%150%，表示基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)烈。

分別配制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液。其中，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇-水(1∶1，V∶V)溶液配制，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制則以空白基質(zhì)代替。分析過程中，分別利用QuChERS和GB/T 20769—2008處理未污染的空白葡萄樣品，完成樣品前處理過程后，在空白基質(zhì)中混配不同濃度水平的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，使目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度梯度為2、5、10、25、50、100和250 μg·L-1，經(jīng)LC-MS/MS分析后，以色譜峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X，μg·L-1)進(jìn)行線性回歸擬合，由此計算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見圖1。同時以藥物在不同葡萄中基質(zhì)效應(yīng)的平均值計，評價2種前處理方法對葡萄基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果見圖2。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)評價

研究結(jié)果表明，葡萄樣品經(jīng)2種前處理方法處理后均存在基質(zhì)效應(yīng)，并以基質(zhì)抑制為主。采用不同的前處理方法時，不同葡萄品種中農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)存在差異。

GB 20769—2008方法采用乙腈萃取，石墨化碳黑-氨基柱凈化，5種葡萄中的農(nóng)藥的SR范圍為36%～174%(圖1)，平均SR為42%～174%(圖2)?；|(zhì)效應(yīng)較為顯著的農(nóng)藥(以平均SR計)為啶蟲脒(59%)、噻蟲嗪(42%)、滅多威(49%)、矮壯素(36%)、吡蟲啉(60%)、多菌靈(60%)、多效唑(151%)和丙環(huán)唑(174%)。不同品種葡萄基質(zhì)間差異較為顯著的農(nóng)藥為噻蟲嗪(陽光玫瑰和新雅基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng))、嘧霉胺(陽光玫瑰和新郁的基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng))和丙環(huán)唑(白羅莎里奧和新郁的基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng))，其他農(nóng)藥受基質(zhì)效應(yīng)的影響偏差可以控制在20%以內(nèi)。

表1 目標(biāo)化合物的LC-MS/MS參數(shù)

注：*為定量離子。

經(jīng)QuChERS方法處理后，5種葡萄中農(nóng)藥的SR為29%～130%(圖1)，平均SR為36%～120%(圖2)；其中基質(zhì)效應(yīng)較為顯著的農(nóng)藥為啶蟲脒(57%)、噻蟲嗪(56%)、滅多威(36%)、矮壯素(50%)。除1-萘乙酸外，色澤對基質(zhì)效應(yīng)的影響偏差可以控制在15%以內(nèi)。

基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)度在藥物間的差異(RSD為2.3%～26.2%)顯著大于葡萄品種間的差異，且QuChERS方法中約73%農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)小于GB/T 20769—2008中的基質(zhì)效應(yīng)。通常認(rèn)為，GB/T 20769—2008是采用更為嚴(yán)格的凈化方法，去除的基體雜質(zhì)更多，基質(zhì)效應(yīng)應(yīng)該低于QuChERS方法。但由于GB/T 20769—2008在前處理過程中，農(nóng)藥與基質(zhì)均被濃縮5倍，而QuChERS方法卻將樣品稀釋了2倍，致使同一樣品經(jīng)GB/T 20769—2008處理后，基質(zhì)效應(yīng)稍強(qiáng)于QuChERS方法。此外，LC-MSMS分析中的基質(zhì)效應(yīng)是極其復(fù)雜的多因素交互影響結(jié)果，樣品的表觀色澤度并不會直接反映基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)度。

因此，基于2種前處理方法聯(lián)合LC-MS/MS分析葡萄中農(nóng)藥殘留時，建議通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，對于受基質(zhì)影響顯著的藥物，建議使用同種葡萄基質(zhì)進(jìn)行定量分析。

圖1 不同葡萄樣品經(jīng)2種方法處理后經(jīng)LC-MS/MS測定時的基質(zhì)效應(yīng)

圖2 2種前處理條件下農(nóng)藥在葡萄中的平均基質(zhì)效應(yīng)

3 小結(jié)

本研究對5種葡萄樣品中26種農(nóng)藥殘留分析時的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價，分別考察前處理方法GB/T 20769—2008和QuChERS進(jìn)行前處理后，結(jié)合LC-MS/MS分析不同農(nóng)藥時的基質(zhì)效應(yīng)差異。結(jié)果表明，QuChERS方法中約73%農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)小于GB/T 20769—2008中的基質(zhì)效應(yīng)；基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)度在農(nóng)藥種類間的差異顯著大于葡萄品種間的差異。LC-MS/MS分析中的基質(zhì)效應(yīng)是極其復(fù)雜的多因素交互影響結(jié)果。因此，在分析葡萄樣品中農(nóng)藥殘留分析時需通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，對于受基質(zhì)影響顯著的藥物建議使用同種葡萄基質(zhì)進(jìn)行定量分析。