趙良中， 崔家博， 馬 靜， 王立國， 方 芳△

(吉林醫(yī)藥學院 1檢驗學院, 2附屬醫(yī)院， 吉林 吉林 132013)

我國前列腺癌的發(fā)病率近年來呈快速上升趨勢。晚期前列腺癌會發(fā)生局部淋巴結和遠處器官的轉(zhuǎn)移，治療效果差。減少前列腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生率在前列腺癌治療過程中非常重要。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的關鍵啟動步驟。有效抑制EMT可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的發(fā)生[1-2]。

胡桃醌(juglone)是從核桃楸中提純的一種天然成分，其具有細胞毒作用，能夠誘導多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡[3-5]。最新研究也表明，胡桃醌具有抑制胰腺癌和卵巢癌細胞侵襲的作用[6-7]。但胡桃醌是否能抑制前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移和EMT及機制還不清楚。本文通過胡桃醌作用前列腺癌細胞，分析胡桃醌對前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移和EMT的作用，揭示其作用機制，為前列腺癌的治療提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

人前列腺癌LNCaP細胞購自上海中國科學院細胞庫。胡桃醌購自Sigma；RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco；胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購自HyClone；兔抗上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、Snail、β-actin 抗體和Wnt通路激活劑LiCl購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 人前列腺癌細胞LNCaP于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)，隔日換液。

2.2細胞活力的檢測 采用MTT比色法，取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度為1×108/L，體積為200 μL，接種于96 孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)。加入不同濃度(6.25、12.5、25、50和100 μmol/L)胡桃醌培養(yǎng)液，每組設3 復孔，同時設立正常對照組。體外培養(yǎng)24 h后MTT法測定吸光度(A)值，實驗重復3次，計算細胞存活率：存活率(%)=實驗組平均A值/對照組平均A值×100%。

2.3Transwell侵襲實驗 取對數(shù)生長期的LNCaP細胞，將200 μL含2×104個細胞的培養(yǎng)液(含0.2%血清)加入到Matrigel包被的Transwell上室，分別加入0、12.5和25 μmol/L胡桃醌，下室加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液500 μL，培養(yǎng)24 h。隨后取出小室，用冰上預冷的PBS 洗滌3 次去除殘余培養(yǎng)基，用濕棉簽擦去小室上層未穿過的細胞，4%多聚甲醛固定20 min 之后，室溫晾干。進一步使用結晶紫染色20 min。隨后用冰上預冷的PBS洗滌3 次，置于倒置顯微鏡下觀察穿過膜的細胞數(shù)。

2.4Western blot實驗 取對數(shù)生長期的LNAaP細胞，分別加入0、12.5和25 μmol/L的胡桃醌作用細胞24 h。加入細胞裂解液，用細胞刮器刮取細胞，4 ℃超聲裂解細胞，4 ℃、12 000×g離心5 min，提取細胞總蛋白，收集上清液測蛋白濃度。根據(jù)說明書提取細胞核蛋白，測蛋白濃度。取30 μg 蛋白進行SDS-PAGE，將凝膠上蛋白移至醋酸纖維素膜，于50 g/L 脫脂奶粉中4 ℃封閉過夜，加兔抗E-cadherin(1∶1 000)、vimentin(1∶1 000)、Snail(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)和β-actin 抗體(1∶3 000)，4 ℃過夜。次日，TBST 洗膜，分別加HRP 標記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)室溫避光孵育2 h。TBST 洗膜，加底物發(fā)光顯影。使用Quantity One 軟件掃描并做灰度分析。

2.5LiCl和胡桃醌聯(lián)合處理細胞 采用Wnt通路激活劑LiCl(5 μmol/L)處理細胞3 h，再加入25 μmol/L胡桃醌作用細胞24 h，然后利用Western blot法測Snail和E-cadherin的蛋白表達。

3 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 胡桃醌抑制LNCaP細胞的活力

不同濃度胡桃醌處理LNCaP細胞24 h 后，與對照組LNCaP細胞存活率100%進行比較，6.25、12.5、25、50和100 μmol/L胡桃醌作用細胞的存活率分別為(92.9±5.8)%、(79.2±2.1)%、(62.2±1.2)%、(39.1±3.1)%和(19.5±1.9)%,計算IC50值為35.89 μmol/L。實驗結果表明，胡桃醌對前列腺癌LNCaP細胞具有細胞毒作用。為了避免高濃度胡桃醌導致細胞大量死亡，影響后續(xù)的實驗結果,我們選擇了12.5 μmol/L和25 μmol/L胡桃醌作用細胞。

2 胡桃醌抑制LNCaP細胞的侵襲能力

Transwell小室實驗結果顯示，與對照組比較，12.5和25 μmol/L胡桃醌可顯著抑制前列腺癌LNCaP細胞的侵襲能力(P<0.01)，見圖1。

3 胡桃醌抑制LNCaP細胞EMT

Western blot法檢測EMT標志物E-cadherin和vimentin的表達。結果表明，與對照組比較，12.5和25 μmol/L胡桃醌組的E-cadherin蛋白表達量增高，25 μmol/L 胡桃醌組的vimentin蛋白表達量下降(P<0.05或P<0.01),見圖2。這一結果提示，胡桃醌可能具有逆轉(zhuǎn)前列腺癌細胞EMT的作用。

Figure 1.The invasion ability of the LNCaP cells treated with juglone at different doses (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1胡桃醌對LNCaP細胞侵襲能力的影響

Figure 2.The protein expression of E-cadherin and vimentin in the LNCaP cells treated with juglone at different doses. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2胡桃醌對LNCaP細胞E-cadherin和vimentin蛋白表達的影響

4 胡桃醌抑制Wnt/β-catenin信號途徑

與對照組比較，12.5和25 μmol/L胡桃醌組β-catenin和Snail蛋白表達降低(P<0.05或P<0.01),見圖3。與25 μmol/L胡桃醌組比較，Wnt激活劑LiCl與胡桃醌聯(lián)合應用導致Snail蛋白表達升高，E-cadherin蛋白表達降低(P<0.01),見圖4。

討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移被認為是引起大多數(shù)腫瘤患者死亡的原因之一。EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期階段，使具有黏附形態(tài)及不具移動能力的上皮細胞極性消失,轉(zhuǎn)變?yōu)椴痪哂袠O性的間質(zhì)細胞，失去細胞間緊密連接，從而使細胞獲得遷移和侵襲能力[8]。組織和器官發(fā)生EMT過程的主要特征包括上皮細胞表型標志物(如E-cadherin)表達的減少及間質(zhì)細胞表型標志物(如vimentin)的上調(diào)。E-cadherin具有維持正常上皮細胞的極性、保持細胞間緊密連接及防治細胞侵襲和轉(zhuǎn)移擴散的作用。因此，E-cadherin的表達下降在EMT發(fā)生過程中起到重要的作用[9]。研究表明，EMT在前列腺癌的轉(zhuǎn)移和治療抵抗中也起到重要的作用，常規(guī)激素療法后殘留的前列腺癌細胞呈顯著EMT表型[9]。因此，發(fā)現(xiàn)有效的治療前列腺癌EMT的藥物至關重要。

胡桃醌是從核桃楸中提純的一種天然成分，已被證明在某些腫瘤細胞中具有抑制細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的功能[3-7]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)胡桃醌能夠抑制前列腺癌LNCaP細胞遷移和侵襲，并促進E-cadherin表達及抑制vimentin的表達的作用。結果表明，胡桃醌可能具有抑制前列腺癌細胞EMT、減少腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用。在EMT的發(fā)生過程中涉及到多種信號通路和誘導分子的調(diào)節(jié)，其中Wnt 信號通路是調(diào)節(jié)EMT的重要途徑之一[10-11], β-catenin是Wnt途徑的關鍵分子。Wnt通路活化后，能夠使β-catenin在細胞核內(nèi)聚集，與T細胞因子/淋巴增強因子形成復合物啟動Snail等目的基因的轉(zhuǎn)錄。Snail是重要的促進EMT的分子，Snail可以直接結合在E-cadherin基因上游的啟動子區(qū)域，通過降低E-cadhe-rin表達促進EMT的發(fā)生[11-13]。我們實驗結果表明，胡桃醌能使β-catenin和Snail蛋白的表達下降，提示胡桃醌可能通過Wnt途徑抑制前列腺癌LNCaP細胞EMT。為了進一步驗證胡桃醌通過Wnt途徑抑制前列腺癌細胞EMT的作用，我們使用了Wnt通路激活劑LiCl處理LNCaP細胞。結果發(fā)現(xiàn)，LiCl能夠拮抗胡桃醌誘導的Snail蛋白的表達下調(diào)，導致E-cadherin表達下調(diào)。

Figure 3.The protein expression of β-catenin and Snail in the LNCaP cells treated with juglone at different doses. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖3胡桃醌對LNCaP細胞β-catenin和Snail蛋白表達的影響

Figure 4.The protein expression of Snail and E-cadherin in the LNCaP cells treated with juglone and LiCl. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsjuglone group.

圖4胡桃醌與LiCl聯(lián)合作用對LNCaP細胞Snail和E-cadherin蛋白表達的影響

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌可能通過阻滯Wnt/β-catenin/Snail信號通路抑制前列腺癌細胞的EMT，從而降低前列腺癌細胞侵襲。本研究明確胡桃醌抑制前列腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移作用，并將其應用與前列腺癌的臨床研究和治療，提供一定的理論基礎。