曲少華， 張 杰， 張 偉， 黃炎華， 張 清， 王寧霞， 呂榮釗△

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科， 廣東 廣州 510630; 2廣東省婦女兒童醫(yī)院生殖中心， 廣東 廣州 511442)

乳腺癌是我國(guó)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高，已成為威脅我國(guó)女性生命的罪魁禍?zhǔn)?。目前，臨床上判斷乳腺癌患者預(yù)后及制定治療方案的指標(biāo)主要有臨床病理指標(biāo)及分子指標(biāo)等,但是，由于乳腺癌異質(zhì)性的存在，這些指標(biāo)均不能完全準(zhǔn)確地反應(yīng)患者預(yù)后。因此，研究并豐富新的生物學(xué)指標(biāo)，成為實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)治療和改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[1]。

腫瘤出芽是指在腫瘤浸潤(rùn)最深處散在分布于間質(zhì)內(nèi)的單個(gè)孤立的癌細(xì)胞或少于5個(gè)癌細(xì)胞組成的癌巢[2],具有上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和腫瘤干細(xì)胞的特性，并且被認(rèn)為是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的早期階段，對(duì)于腫瘤的進(jìn)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。然而，腫瘤出芽在乳腺癌中的研究較少，其與乳腺癌臨床病理指標(biāo)、腫瘤免疫微環(huán)境和預(yù)后之間的關(guān)系鮮少報(bào)道。乳腺癌腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)作為腫瘤免疫微環(huán)境中的重要成分，與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)，并能預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效，近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)。然而，腫瘤出芽與腫瘤免疫微環(huán)境中TILs之間的關(guān)系未知。本研究通過(guò)收集乳腺癌組織標(biāo)本178例，探討腫瘤出芽與乳腺癌臨床病理特征、腫瘤免疫微環(huán)境中TILs及預(yù)后的關(guān)系，為乳腺癌診治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 一般資料

收集2012年1月～2016年12月于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科確診的浸潤(rùn)性乳腺癌患者資料及腫瘤組織石蠟切片，排除雙側(cè)乳腺癌和浸潤(rùn)性微乳頭狀癌等少見(jiàn)類型、非乳腺癌死亡、失訪、新輔助化療、病例資料不完整及初診時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，共178例用于本研究。所有患者均為女性，一般情況良好，Karnofsy評(píng)分均為80分以上。所有入組病例的臨床病理資料完整，包括患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、輔助治療、分子分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。隨訪均從術(shù)后第1天開(kāi)始，中位隨訪時(shí)間是48個(gè)月(13～65個(gè)月)，術(shù)后3年內(nèi)每3個(gè)月復(fù)查1次，術(shù)后3～5年每6個(gè)月復(fù)查1次，5年后每12個(gè)月復(fù)查1次。隨訪信息通過(guò)電話隨訪或門(mén)診隨訪獲得。無(wú)病生存期(disease-free survival， DFS)定義為從隨訪開(kāi)始至疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、進(jìn)展或由于疾病進(jìn)展導(dǎo)致死亡的時(shí)間;總生存期(overall survival, OS)定義為從隨訪開(kāi)始至患者死亡的時(shí)間。

2 腫瘤出芽的判讀

腫瘤出芽的判斷根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]，即散在分布于腫瘤浸潤(rùn)最深的間質(zhì)內(nèi)單個(gè)孤立的癌細(xì)胞或少于5個(gè)癌細(xì)胞組成的癌巢為腫瘤出芽；而腫瘤浸潤(rùn)最深的間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)單個(gè)癌細(xì)胞或癌巢則為無(wú)出芽。在顯微鏡(×200)下，選取5個(gè)腫瘤出芽最密集的視野，觀察腫瘤出芽情況，其中單個(gè)視野中出芽最多的個(gè)數(shù)即為腫瘤出芽數(shù)。

3 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的水平檢測(cè)及判讀標(biāo)準(zhǔn)

所有腫瘤組織均用福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋制成蠟塊，4 μm連續(xù)切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅(haematoxylin and eosin, HE)染色,由2位病理科醫(yī)師按照Salgado等[4]的方法進(jìn)行HE切片評(píng)估：在顯微鏡低倍視野下選定有代表性的切片，在200倍視野下評(píng)估并記錄TILs數(shù)目，包括單核的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞。TILs的水平以其占浸潤(rùn)性乳腺癌邊界處的周圍間質(zhì)細(xì)胞的百分比來(lái)表示，而遠(yuǎn)離腫瘤邊界、原位癌和正常乳腺小葉周圍的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞不計(jì)數(shù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)資料應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用2檢驗(yàn)分析腫瘤出芽情況與臨床病理特征和TILs之間的關(guān)系，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間差異采用log-rank檢驗(yàn)分析，繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線確定臨界(cut-off)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳腺癌組織中腫瘤出芽及TILs浸潤(rùn)情況

為了研究乳腺癌組織中腫瘤出芽情況，我們首先通過(guò)繪制ROC曲線來(lái)確定腫瘤出芽數(shù)量的臨界值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽數(shù)目為10時(shí)，敏感性和特異性最好(AUC=0.754，P<0.001)。因此，以10為臨近值，將腫瘤出芽數(shù)≤10個(gè)分為低腫瘤出芽組，將腫瘤出芽數(shù)>10個(gè)分為高腫瘤出芽組。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，178例患者分為低腫瘤出芽組患者99例和高腫瘤出芽組患者79例，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The cut-off of tumor budding defined by ROC curve (n=178).

圖1ROC曲線判定腫瘤出芽臨界值

根據(jù)Hida等[5]的方法將TILs的浸潤(rùn)程度分級(jí)，在顯微鏡低倍視野下選定有代表性的切片，評(píng)估TILs所占腫瘤細(xì)胞及周圍間質(zhì)細(xì)胞的比例：<50%為低TILs組，>50%為高TILs組。因此，178例患者中，87例為低TILs組，91例為高TILs組，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The expression of tumor budding and tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer patients.

圖2腫瘤出芽和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在乳腺癌組織中的表達(dá)情況

2 乳腺癌腫瘤出芽情況與臨床病理特征和TILs水平之間的關(guān)系

分析腫瘤出芽的水平與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)，高腫瘤出芽與淋巴結(jié)陽(yáng)性、組織學(xué)分級(jí)高、脈管癌栓侵襲(lymphovascular invasion, LVI)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡、腫瘤大小、Ki67和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2 (human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)等無(wú)關(guān)，見(jiàn)表1。

進(jìn)一步研究腫瘤出芽情況與TILs水平的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)，腫瘤出芽的水平與TILs的水平呈反比，即腫瘤出芽數(shù)量多的患者其TILs的比例低，而腫瘤出芽數(shù)量少的患者其TILs的比例高，提示我們，腫瘤出芽與TILs負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表2。

3 乳腺癌腫瘤出芽水平與患者預(yù)后的關(guān)系

經(jīng)隨訪48個(gè)月之后，低腫瘤出芽組中有6人疾病進(jìn)展(其中骨轉(zhuǎn)移4人，肝轉(zhuǎn)移2人)，高腫瘤出芽組中有13人疾病進(jìn)展(其中骨轉(zhuǎn)移7人，肝轉(zhuǎn)移3人，肺轉(zhuǎn)移2人，腦轉(zhuǎn)移1人)。應(yīng)用Kaplan-Merier生存分析發(fā)現(xiàn)，低腫瘤出芽組無(wú)病生存率為91.7%，而高腫瘤出芽組無(wú)病生存率為86.3%，兩組之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2=5.796,P=0.016)，見(jiàn)圖3A。此外，低腫瘤出芽組1人死亡，高腫瘤出芽組5人死亡，應(yīng)用Kaplan-Merier生存分析發(fā)現(xiàn)，低腫瘤出芽組總生存率為97%，而高腫瘤出芽組總生存率為93.1%(2=4.362,P=0.037)，見(jiàn)圖3B。提示我們，低腫瘤出芽組的無(wú)病生存率和總生存率均高于高腫瘤出芽組。

表1腫瘤出芽與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

Table 1.Association between tumor budding and clinicopathologic features of breast cancer patients

ItemTotal No.Tumor buddingLowHigh2PAge(years)0.660.417 ≤45694128 >451095851Tumor size0.4380.803 T1633627 T2975245 T318117Nuclear grade6.6940.035 Grade I473116 Grade II744430 Grade III572433Lymph node status9.5050.023 N0433013 N1623824 N2482127 N3251015LVI6.0810.014 No865630 Yes924349Hormone receptor status0.7630.382 ER/PR positive1217051 ER/PR negative572928Ki670.3610.548 Low724230 High1065749HER-2 status0.2030.652 Negative1387860 Positive402119Recurrence4.9800.026 No1599366 Yes19613

表2腫瘤出芽與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞之間的關(guān)系

Table 2.Association between tumor budding and tumor-infiltrating lymphocytes

ItemTotal No.Tumor-infiltratinglymphocytesLowHigh2PTumor budding6.4080.011 Low994059 High794732

Figure 3.Kaplan-Meier survival curves (Log rank) of disease free survival (A) and overall survival (B) according to the tumor budding levels.

圖3腫瘤出芽水平與乳腺癌患者無(wú)病生存率和總生存率的關(guān)系

討 論

本研究分析腫瘤出芽水平與乳腺癌患者臨床病理特征及患者預(yù)后之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌腫瘤出芽較高的患者，淋巴結(jié)分級(jí)高，組織學(xué)分級(jí)高，脈管癌栓浸潤(rùn)較多，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移較多，預(yù)后較差。在此基礎(chǔ)上，本課題進(jìn)一步研究腫瘤出芽與免疫微環(huán)境中TILs的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤出芽水平與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的水平呈負(fù)相關(guān)，提示我們腫瘤出芽與腫瘤免疫微環(huán)境之間可能存在復(fù)雜關(guān)系，腫瘤出芽與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞可能相互作用，進(jìn)而影響乳腺癌患者預(yù)后。

腫瘤出芽是分布在腫瘤間質(zhì)內(nèi)的單個(gè)腫瘤細(xì)胞或小于5個(gè)腫瘤細(xì)胞組成的癌巢。既往研究證實(shí)，腫瘤出芽與結(jié)直腸癌、鼻咽癌和膀胱癌等的預(yù)后相關(guān)[6]。腫瘤出芽是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的早期階段，且具有遷移和侵襲的特性，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。而轉(zhuǎn)移是由多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路協(xié)同，細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境共同作用及多個(gè)環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜過(guò)程。有研究者提出的“種子與土壤學(xué)說(shuō)”，將出芽的腫瘤細(xì)胞看作是“種子”，“種子”進(jìn)入血管，遇到適合的“土壤”時(shí)發(fā)生種植，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。而腫瘤出芽在乳腺癌中的研究相對(duì)較少，僅有少數(shù)文章報(bào)道腫瘤出芽與乳腺癌臨床病理特征及患者預(yù)后之間的關(guān)系，且研究結(jié)論卻并不一致。Salhia等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在ER陽(yáng)性乳腺患者中，腫瘤出芽與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而在三陰乳腺癌患者中，腫瘤出芽與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌腫瘤出芽與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與年齡和腫瘤大小等無(wú)關(guān)。Liang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌腫瘤出芽與腫瘤大小較大、脈管浸潤(rùn)和總生存率有關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、HR及HER2無(wú)關(guān)。Gujam等[10]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌高腫瘤出芽與ER陽(yáng)性狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)，而與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)和Ki67無(wú)關(guān)；在Luminal B型、三陰型和HER2陽(yáng)性型乳腺癌患者中，高腫瘤出芽與患者預(yù)后較差相關(guān)，而在Luminal A型乳腺癌中，腫瘤出芽與預(yù)后無(wú)關(guān)。本研究通過(guò)收集178例乳腺癌患者病例資料及HE病理切片，發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽與淋巴結(jié)分級(jí)高、組織學(xué)分級(jí)高、脈管癌栓多及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小、激素受體和HER2無(wú)關(guān)，提示我們，腫瘤出芽與乳腺癌惡性進(jìn)展有關(guān)。

既往鮮有研究報(bào)道腫瘤出芽與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系[7, 9]，且乳腺癌腫瘤出芽的評(píng)估方法并不一致。Gujam等[10]采用半定量的方法來(lái)判讀乳腺癌腫瘤出芽的高低，而Li等[8]則根據(jù)腫瘤出芽的平均值來(lái)判定腫瘤出芽的水平，分析腫瘤出芽的水平與患者預(yù)后的關(guān)系。在本研究中，我們觀察常規(guī)HE染色切片中腫瘤出芽讀數(shù)，以O(shè)S為研究終點(diǎn)，繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽數(shù)為10時(shí)，敏感性和特異性最好，并以此為界判定腫瘤出芽水平的高低。應(yīng)用Kaplan-Merier生存分析， log-rank檢驗(yàn)繪制生存曲線，發(fā)現(xiàn)高腫瘤出芽與乳腺癌患者預(yù)后較差有關(guān)，由此推測(cè)腫瘤出芽可成為預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的新指標(biāo)。

近年來(lái)，腫瘤免疫微環(huán)境及免疫治療因其在抗腫瘤治療中的潛在作用而受到越來(lái)越多的關(guān)注。其中，間質(zhì)內(nèi)的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要成分，是機(jī)體應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)腫瘤免疫應(yīng)答的重要機(jī)制，TILs的數(shù)量能夠在一定程度上反應(yīng)機(jī)體對(duì)抗腫瘤的能力。IBCSG 22-00、BIG 2-98、FinHER、ECOG 2197，ECOG 1199及NEAT/BR9601等大型臨床研究均證實(shí)，TILs可改善乳腺癌無(wú)復(fù)發(fā)生存率[11]。Denkert等[12]證實(shí)，TILs可預(yù)測(cè)接受蒽環(huán)類和紫杉類新輔助化療的療效和患者預(yù)后，并且是病理完全緩解率PCR的預(yù)測(cè)因子。

那么，乳腺癌腫瘤出芽與腫瘤免疫微環(huán)境中TILs兩者之間的關(guān)系如何呢？Lugli等[3]發(fā)現(xiàn)，CD8+T淋巴細(xì)胞與腫瘤出芽的比值是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。Zlobec等[13]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中，TILs的數(shù)量與腫瘤出芽的數(shù)量呈明顯負(fù)相關(guān)，并認(rèn)為T(mén)ILs與腫瘤出芽相互作用，改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，腫瘤出芽的水平與TILs的數(shù)量呈相反趨勢(shì)，腫瘤出芽數(shù)量少的患者TILs較多，預(yù)后較好；而腫瘤出芽數(shù)量多的患者TILs較少，預(yù)后較差，提示我們?nèi)橄侔┠[瘤出芽與TILs相互作用，調(diào)控乳腺癌的發(fā)展，影響患者預(yù)后。然而，腫瘤出芽與TILs之間相互關(guān)系及相互作用機(jī)制的尚未闡明。既往研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤出芽和EMT的過(guò)程中伴隨著腫瘤免疫微環(huán)境的變化，如產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)和白細(xì)胞介素10(interleuk-in-10,IL-10)等；而腫瘤微環(huán)境中的缺氧因子、代謝產(chǎn)物和炎癥因子等在誘導(dǎo)腫瘤出芽的形成、EMT及轉(zhuǎn)移灶的種植過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-200能夠在抑制EMT的同時(shí)促進(jìn)TILs免疫應(yīng)答，從而抑制非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。提示我們腫瘤出芽與TILs之間可能通過(guò)細(xì)胞因子、microRNA、炎性因子等聯(lián)系起來(lái)，但具體的作用機(jī)制仍需深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌腫瘤出芽水平與TILs呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)了腫瘤出芽與乳腺癌臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系，為乳腺癌診治提供潛在的生物學(xué)指標(biāo)，豐富了抗腫瘤免疫治療的依據(jù)。但值得注意的是，腫瘤出芽和TILs的判讀尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此，兩者能否作為臨床常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)用于臨床工作仍需更多的研究。