杜 玥， 張 鴻， 竇曹帥， 談錦萍， 付 蕾，史 偉， 梁馨苓， 劉雙信， 章 斌△

(1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510006； 2廣東省人民醫(yī)院腎內(nèi)科， 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 廣東 廣州 510080)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因[1-2]。足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病的進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，近年來受到研究者的重視[3-4]。國內(nèi)外[5-7]和本課題組[8]研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子——活化T細(xì)胞核因子胞漿1型 (nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1，NFATc1)是影響足細(xì)胞損傷、凋亡及腎小球硬化的關(guān)鍵因子。靜息狀態(tài)，NFATc1以磷酸化形式存在細(xì)胞質(zhì)中，損傷刺激時，Ca2+內(nèi)流，活化鈣調(diào)磷酸酶，NFATc1去磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，啟動下游目的基因的轉(zhuǎn)錄[9]。我們前期的其它研究顯示，在慢性腎臟病的動物模型中，包括脂多糖腎病、5/6 腎大部切除腎病和糖尿病腎病動物模型，足細(xì)胞NFATc1都扮演了重要的致病角色[10-12]。這些證據(jù)促使我們進(jìn)一步思考足細(xì)胞NFATc1活化的調(diào)控機(jī)制。

鳥苷酸交換因子Sos(Son of Sevenless)是一種Ras激活劑，可引起GTP/GDP交換，哺乳動物Sos家族由2個成員——Sos1和Sos2組成[13]。以往研究表明，Sos1和Sos2參與外周CD4+T細(xì)胞中PI3K通路的調(diào)節(jié)[14]。在腎臟病研究領(lǐng)域，大規(guī)模外顯子組分析顯示，Sos2在腎臟的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[15]。但Sos2在腎小球足細(xì)胞中的功能，目前國內(nèi)外尚無報(bào)道。本研究擬通過人類糖尿病腎病及細(xì)胞模型觀察Sos2在足細(xì)胞中的表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Sos2對足細(xì)胞損傷和活動性的影響，并進(jìn)一步探究Sos2是否可通過影響NFATc1的入核對足細(xì)胞損傷產(chǎn)生影響。

材 料 和 方 法

1 主要儀器和試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo；臺式離心機(jī)和加樣器購自Eppendorf；冷凍高速離心機(jī)購自Beckman；電泳系統(tǒng)購自Bio-Rad；激光共聚焦顯微鏡購自Zeiss。

胎牛血清、0.05%胰酶和Opti-MEM培養(yǎng)液購自Gibco；DMEM培養(yǎng)液購自Corning；干擾素γ購自ProSpec；核漿蛋白提取試劑盒購自廣州凱基生物公司；NFATc1抗體購自Abcam；GAPDH 抗體購自Bioworld； histone抗體和DAPI購自Cell Signaling Technology；抗podocin抗體、Tris、甘氨酸、丙烯酰胺和Ⅰ型鼠尾膠原購自Sigma；抗synaptopodin、Sos2和NFATc1抗體購自Santa Cruz；驢抗兔熒光II抗488購自Thermo Fisher Scientific；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GREEN購自TaKaRa；羊抗鼠熒光II抗546、 Lipofectamine 2000和TRIzol購自Life Technologies；Sos2 siRNA購自廣州銳博生物公司。

2 主要方法

2.1足細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 條件永生化小鼠足細(xì)胞系由美國Jochen Reiser教授(Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA)惠贈。足細(xì)胞先在33 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中增殖，細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%時轉(zhuǎn)入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中分化，在37 ℃培養(yǎng)10～12 d，足細(xì)胞分化成熟。本實(shí)驗(yàn)所有足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均在分化成熟后進(jìn)行。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，為明確高糖(high glucose, HG)刺激下腎組織及足細(xì)胞中Sos2的表達(dá)，分組如下：正常對照組(control組)：含5.3 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)48 h；甘露醇(mannitol, MA)對照組(MA組)：含5.3 mmol/L葡萄糖和24.7 mmol/L甘露醇的DMEM培養(yǎng)48 h； HG組：含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)48 h。為探討過表達(dá)Sos2對足細(xì)胞podocin表達(dá)、活動性及NFATc1入核的影響，分組如下：過表達(dá)對照組(pHBAd+HG組)：含5.3 mmol/L葡萄糖的無血清DMEM培養(yǎng)液及5 μL pHBAd腺病毒干預(yù)24 h后高糖刺激48 h；過表達(dá)組(Sos2+HG組)：含5.3 mmol/L葡萄糖的無血清DMEM培養(yǎng)液及5 μL pHBAd-Sos2腺病毒干預(yù)24 h后高糖刺激48 h。為探討沉默Sos2對足細(xì)胞podocin表達(dá)、活動性及NFATc1入核的影響，分組如下：正常對照組(control組)、control siRNA組、Sos2 siRNA1組和Sos2 siRNA2組，siRNA濃度均為50 nmol/L。

2.2病毒感染 足細(xì)胞分化成熟后，向含有5 mL無血清的DMEM培養(yǎng)液中加入5 μL的腺病毒液，感染24 h后，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，換成普通含有5%血清的DMEM培養(yǎng)液，再做其它干預(yù)。

2.3siRNA轉(zhuǎn)染 足細(xì)胞分化成熟后將含有50 nmol/L siRNA與8 μL Lipofectamine 2000的混合液加入無血清無抗生素培養(yǎng)液內(nèi)，6 h后換成5% 血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.4免疫熒光染色 腎組織或足細(xì)胞先進(jìn)行冰甲醇固定、0.5% Triton X-100透化、5%BSA封閉，再孵育I抗4 ℃過夜，然后用相應(yīng)的熒光II抗避光孵育及DAPI染核，封片，激光共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察，所用圖片均在400倍鏡下拍攝。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 收集蛋白后用BCA法測蛋白濃度，加入蛋白變性液煮沸變性。蛋白加入到7.5%、9%凝膠進(jìn)行SDS-PAGE、200 mA恒流濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%牛奶封閉1 h，I抗4 ℃孵育過夜，用相應(yīng)II抗室溫孵育1 h后，使用電化學(xué)發(fā)光液(ECL)進(jìn)行曝光。ImageJ軟件分析條帶的灰度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6RT-PCR TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒說明書操作檢測目的基因表達(dá)。引物序列：Sos2正義鏈5’-TCACAGGACATTCTTGCACCA-3’，反義鏈5’-CTTAAAGCCGTCAGCAATGGA-3’；GAPDH 正義鏈5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反義鏈5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’；Plaur正義鏈5’-GACTACCGTGCTTCGGGAATG -3’,反義鏈5’-ATGGTCCTGTTGGTCTTTTCG -3’；Wnt6正義鏈5’-CTCCTACAGTGTGGTTGTCAGG-3’，反義鏈5’-GCGCATCCATAAAGAGTCTTGA-3’；Fzd9正義鏈5’-CGCACGCACTCTGTATGGAG-3’,反義鏈5’-GCCGAGACCAGAACACCTC-3’；Rcan1正義鏈5’-CTCCTCCCGTTGGCTGGAAA-3’，反義鏈5’-CTGGGAGTGGTGTCTGTCGC-3’。反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性10 s， 60 ℃退火25 s， 72 ℃延伸25 s，此3步共循環(huán)40次； 72 ℃終止5 min；每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，定量結(jié)果取平均值。

2.7劃痕實(shí)驗(yàn) 將已分化成熟的足細(xì)胞按每孔1×108/L數(shù)量接種到6孔板，5%CO2、37 ℃孵育過夜。用1 mL無菌吸頭末端刮除每孔蓋玻片上的細(xì)胞，刮出“井”字，PBS輕輕洗滌1次后換上新鮮的培養(yǎng)液， 進(jìn)行過表達(dá)或沉默處理，按上述實(shí)驗(yàn)時間后，進(jìn)行高糖處理48 h。處理結(jié)束后去上層培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌2次，-20 ℃冰甲醇固定15 min，PBS洗3次，0.5% Triton X-100透化10 min，PBS洗3次。DAPI染色10 min顯示細(xì)胞核，避光PBS洗3次后封片，置于熒光顯微鏡下觀察，所用圖片均在100倍鏡下拍攝。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Sos2在糖尿病腎病患者的足細(xì)胞中表達(dá)降低

免疫熒光染色通過腎小球足細(xì)胞標(biāo)志蛋白synaptopodin定位足細(xì)胞，結(jié)果顯示正常腎組織的足細(xì)胞中Sos2的表達(dá)量較多,而在糖尿病腎病患者的腎小球足細(xì)胞內(nèi)Sos2的表達(dá)量顯著減少，見圖1。

Figure 1.Sos2 was decreased in podocytes of diabetic nephropathy (DN) patients. Sos2 protein (red) was found in podocytes, as shown by double immunofluorescence with the podocyte marker synaptopodin (green) resulting in a partial yellow overlap. Scale bar is 25 μm.

圖1Sos2在糖尿病腎病患者的足細(xì)胞中表達(dá)降低

2 Sos2在高糖刺激體外培養(yǎng)的足細(xì)胞中表達(dá)降低

用30 mmol/L葡萄糖處理足細(xì)胞48 h，RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與對照組和甘露醇組比較，高糖組Sos2的表達(dá)均顯著降低(P<0.05),見圖2A、B。同時，免疫熒光染色后，通過DAPI來定位細(xì)胞核，腎小球足細(xì)胞標(biāo)志蛋白synaptopodin來定位足細(xì)胞，疊加結(jié)果顯示HG干預(yù)足細(xì)胞可使Sos2表達(dá)顯著減少，見圖2C。

Figure 2.Sos2 was decreased in high glucose (HG)-treated podocytesinvitro. A and B: RT-PCR and Western blot showed an lower level of Sos2 in podocytes with HG； C: Sos2 protein (red) was found in podocytes, as shown by double immunofluorescence with the podocyte marker synaptopodin (green) resulting in a partial yellow overlap. Scale bar is 25 μm. Mean±SD.n=3．*P<0.05vscontrol group.

圖2HG體外處理后足細(xì)胞Sos2表達(dá)降低

3 過表達(dá)及沉默足細(xì)胞中Sos2效率的驗(yàn)證

RT-PCR結(jié)果顯示Sos2 siRNA1的沉默水平可達(dá)到對照組的46%(P<0.05)，Sos2 siRNA2的沉默水平可達(dá)到對照組的46%(P<0.05)，Sos2過表達(dá)水平可達(dá)到對照組的15.98倍(P<0.05)。同時，Western blot結(jié)果顯示Sos2 siRNA1的沉默水平可達(dá)到對照組的36%(P<0.05)，Sos2 siRNA2的沉默水平可達(dá)到對照組的44%(P<0.05)，Sos2過表達(dá)水平可達(dá)到對照組的5.67倍(P<0.05),見圖3。本實(shí)驗(yàn)可明確Sos2過表達(dá)及沉默水平皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

Figure 3.The efficiency validation ofSos2 overexpression (C, D) and silencing (A, B)invitroby RT-PCR (A, C) and Western blot (B, D). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscontrol siRNA group;△P<0.05vspHBAd group.

圖3體外Sos2過表達(dá)和沉默效率的驗(yàn)證

4 調(diào)控Sos2對足細(xì)胞podocin蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，沉默Sos2后，podocin的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而在高糖刺激下過表達(dá)Sos2后，podocon的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示，沉默Sos2后，podocin的表達(dá)相比對照組有顯著損傷且無序，高糖條件下過表達(dá)Sos2時，podocin的表達(dá)更加明顯和規(guī)則,見圖4。

5 調(diào)控Sos2對足細(xì)胞活動性的影響

通過劃痕實(shí)驗(yàn)來觀察足細(xì)胞在不同條件下的活動性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在Sos2沉默時，與control組和control siRNA組比較，足細(xì)胞的遷移數(shù)目明顯增多(P<0.05)。反之，在高糖條件下，當(dāng)過表達(dá)Sos2時，與pHBAd+HG組相比，足細(xì)胞的遷移數(shù)目明顯降低(P<0.05),見圖5。

6 調(diào)控Sos2對足細(xì)胞NFATc1入核的影響

由足細(xì)胞核蛋白Western blot及定量分析結(jié)果觀察到，沉默Sos2時，NFATc1的入核顯著增加(P<0.05)；高糖條件下過表達(dá)Sos2時，NFATc1的入核顯著降低(P<0.05)。而觀察總蛋白Western blot結(jié)果可知，在沉默和過表達(dá)Sos2后，總蛋白中NFATc1基本沒有變化。同時，檢測NFATc1下游目的基因的轉(zhuǎn)錄情況，沉默Sos2時，NFATc1入核后的下游目的基因Plaur、Rcan1、Wnt6和Fzd9[5]轉(zhuǎn)錄水平顯著增高(P<0.05)；高糖條件下過表達(dá)Sos2時，Plaur、Rcan1、Wnt6和Fzd9轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05),見圖6。

討 論

糖尿病腎病是全球衛(wèi)生問題之一，是糖尿病導(dǎo)致的腎臟損害，其發(fā)病機(jī)制與多種因素密切相關(guān)[16]。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，幾乎所有的腎小球疾病都與足細(xì)胞損傷有關(guān)[17]。因此，闡明糖尿病腎病足細(xì)胞損傷機(jī)制將有助于提供防治DN的新策略。

以往研究表明[18]，Sos2作為一種Ras、Rac鳥苷酸交換因子，可使GDP帶上磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為GTP，從而使Ras激活。Sos2蛋白在人類腎臟的腎小球和腎小管中有表達(dá)[19]。2016年，一項(xiàng)大規(guī)模外顯子組分析顯示，Sos2可調(diào)節(jié)腎臟發(fā)育和功能[15]。但是，在足細(xì)胞中，Sos2的表達(dá)和效應(yīng)尚未有報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)在人類腎小球足細(xì)胞及體外培養(yǎng)足細(xì)胞中均有Sos2的表達(dá)，且在糖尿病腎病患者足細(xì)胞中表達(dá)減少，體外培養(yǎng)的足細(xì)胞在高糖環(huán)境中也表達(dá)減少，因此我們推測Sos2的表達(dá)變化極有可能與足細(xì)胞損傷有關(guān)。

Figure 4.Sos2 affected podocin expression in the podocytes. A and B: Western blot showed the expression of podocin in the podocytes; C: immunofluorescence staining showed the expression of podocin in the podocytes (green). Scale bar is 50 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscontrol siRNA group;△P<0.05vspHBAd+HG group.

圖4調(diào)控Sos2對足細(xì)胞podocin蛋白表達(dá)的影響

有研究證實(shí)[20]，podocin編碼基因NPHS2敲除小鼠病理表現(xiàn)為嚴(yán)重的系膜硬化，電鏡可觀察到足突廣泛融合，裂孔膜消失。足細(xì)胞受損時，足細(xì)胞標(biāo)志蛋白podocin表達(dá)下降[21]。同時，足細(xì)胞活動性的增強(qiáng)也是足細(xì)胞的一個重要損傷因素，在體內(nèi)會引起足細(xì)胞足突的融合甚至足細(xì)胞丟失導(dǎo)致蛋白尿，在體外表現(xiàn)為足細(xì)胞活動性的增強(qiáng)同足突融合有著相似的機(jī)理[22]，抑制損傷足細(xì)胞的活動性是公認(rèn)的保護(hù)足細(xì)胞的關(guān)鍵之一。本實(shí)驗(yàn)中，為了探究Sos2在足細(xì)胞中的效應(yīng)，我們首先在體外調(diào)控足細(xì)胞中Sos2的表達(dá)，采用Sos2 siRNA下調(diào)Sos2的表達(dá)，過表達(dá)Sos2的腺病毒上調(diào)Sos2的表達(dá)。通過觀察不同條件下podocin的表達(dá)，來證明足細(xì)胞的損傷情況；同時通過劃痕實(shí)驗(yàn)來觀察足細(xì)胞在不同條件下的活動性。以上結(jié)果表明，Sos2對足細(xì)胞具有保護(hù)作用，可抑制足細(xì)胞遷移，保持足細(xì)胞相對穩(wěn)定的狀態(tài)，即對于足細(xì)胞而言Sos2是一個保護(hù)因子。

我們進(jìn)一步研究Sos2在足細(xì)胞中的保護(hù)作用機(jī)制時觀察到，過表達(dá)足細(xì)胞中的Sos2時，NFATc1入核明顯減少，下游目的基因Plaur、Rcan1、Wnt6和Fzd9轉(zhuǎn)錄水平隨之降低；沉默Sos2時，NFATc1的入核明顯增加，下游目的基因轉(zhuǎn)錄水平隨之升高，這提示我們Sos2對足細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)與核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1有關(guān)。NFATc1是核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞受到損傷刺激引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子增加時，鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin, CaN) 活化，催化NFATc1去磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，啟動下游目的基因的轉(zhuǎn)錄[9]。在足細(xì)胞，本課題組[8, 10-11, 23]和國內(nèi)外研究者[5, 24-25]報(bào)道，CaN-NFATc1信號軸活化導(dǎo)致足細(xì)胞損傷、凋亡和腎小球硬化，這反映了經(jīng)典通路CaN-NFATc1在腎小球疾病發(fā)病機(jī)制中的核心地位。本實(shí)驗(yàn)明確了Sos2可抑制NFATc1的入核，參與了經(jīng)典通路CaN-NFATc1[9]的調(diào)控，從而保護(hù)足細(xì)胞，但是Sos2是通過何種途徑對NFATc1進(jìn)行調(diào)控，目前尚未明確，需進(jìn)一步探索。

Figure 5.The effects of Sos2 on the motility of podocytes (DAPI staining). Scale bar is 100 μm. Mean±SD.n=3．*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscontrol siRNA group;△P<0.05vspHBAd+HG group.

圖5Sos2可抑制足細(xì)胞的遷移

本研究首次發(fā)現(xiàn)鳥苷酸交換因子Sos2在足細(xì)胞中有表達(dá)，且在足細(xì)胞中Sos2是一個保護(hù)因子，介導(dǎo)足細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制是通過抑制NFATc1入核，降低NFATc1活性。本研究從一個全新的視角探究NFATc1的調(diào)控機(jī)制，豐富了CaN-NFATc1信號軸機(jī)制，為臨床治療糖尿病腎病提供新的干預(yù)策略。Sos2作為鳥苷酸交換因子，是通過何種機(jī)制對足細(xì)胞podocin表達(dá)和細(xì)胞活動性進(jìn)行調(diào)控，是通過何種途徑對NFATc1入核進(jìn)行調(diào)控;且在人類糖尿病腎組織的免疫熒光染色觀察到足細(xì)胞中Sos2表達(dá)降低，Sos2是否在內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞中也表達(dá)?后續(xù)我們將繼續(xù)探究相關(guān)問題，并構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型，進(jìn)一步驗(yàn)證Sos2對腎臟損傷的影響及和NFATc1之間的關(guān)系，從而為Sos2應(yīng)用于臨床提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 6.Sos2 inhibited the translocation of NFATc1 into the nucleus. A and B: Western blot showed NFATc1 protein level in the nucleus; C and D: Western blot showed total NFATc1 protein level in podocytes; E and F: RT-PCR showed the expression of downstream target genes for NFATc1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscontrol siRNA group;△P<0.05vspHBAd+HG group.

圖6Sos2抑制NFATc1入核