劉 菡， 羅永杰

(1西南醫(yī)科大學(xué), 四川 瀘州 646000； 2四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 四川 成都 610000)

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是嚴(yán)重威脅我國(guó)國(guó)民健康的腦血管疾病之一，具有高死亡率和高致殘率，且其發(fā)病呈逐年升高的趨勢(shì)，成為臨床上亟待攻克的焦點(diǎn)問(wèn)題之一[1-3],而恢復(fù)AIS腦組織血液灌注極易引起缺血/再灌注(ische-mia/reperfusion，I/R)損傷[4]。依達(dá)拉奉(edaravone)是一種自由基清除劑，能控制腦水腫，并能減輕腦組織缺血再灌注損傷，常用于治療腦梗死[5-6]。目前雖然關(guān)于依達(dá)拉奉治療腦梗死的研究較多，但關(guān)于依達(dá)拉奉對(duì)急性缺血性腦卒中神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制依然不太明確，因此探討依達(dá)拉奉對(duì)急性腦缺血/再灌注大鼠的實(shí)驗(yàn)效果及其作用機(jī)制，為其在AIS臨床治療方面提供理論根據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康雄性SPF級(jí)SD大鼠136只，體質(zhì)量180～200 g，平均(190.0±5.5) g，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均喂養(yǎng)在光照12 h，濕度45%～60%，溫度23 ℃～25 ℃，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(滇)2016-0014，飼養(yǎng)在自由進(jìn)食進(jìn)水的環(huán)境中。

2 藥品和試劑

依達(dá)拉奉(20 mL∶30 mg，批號(hào)141109)購(gòu)自昆明積大制藥有限公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen；引物合成由北京華大基因公司合成；qPCR試劑為大連寶生物SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒；抗水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)多克隆抗體和抗β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)多克隆抗體購(gòu)自Proteintech。

3 方法

3.1大鼠局灶性腦缺血再灌注的造模方法 采用Longa改良線栓法構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，模擬急性缺血性腦卒中治療[7]。用 10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射將大鼠麻醉后固定，取頸正中切口，分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，在右側(cè)頸總動(dòng)脈近交叉約5 mm處剪一個(gè)小口，用直徑0.28 mm的魚(yú)線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，遇輕微阻力止，插入深度為20～22 mm，近端打活結(jié)，阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈血流，縫合皮膚。拴塞2 h后，拔出10 mm魚(yú)線行再灌注；假手術(shù)(sham)組大鼠制備頸內(nèi)動(dòng)脈不插魚(yú)線，其余操作同手術(shù)組；低劑量(low dose)組和高劑量(high dose)組大鼠于術(shù)前30 min腹腔注射依達(dá)拉奉6 mg/kg和依達(dá)拉奉10 mg/kg，造模后每24 h 腹腔注射給藥1次，假手術(shù)組給予等量生理鹽水，模型(model)組造模后給予等量生理鹽水。采用Longa法對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行鑒定:納入模型組、低劑量和高劑量組中大鼠清醒后(術(shù)后60 min)行走時(shí)向損傷對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)和行走時(shí)向損傷對(duì)側(cè)傾倒的大鼠，排除無(wú)自發(fā)活動(dòng)或死亡大鼠,其中排除模型組1只當(dāng)場(chǎng)死亡，1只無(wú)自發(fā)活動(dòng)；假手術(shù)組、低劑量組和高劑量組各2只無(wú)自發(fā)活動(dòng)，以上均是手術(shù)操作不當(dāng)所致，共納入SD大鼠128只進(jìn)行研究。

3.2神經(jīng)功能評(píng)分 采用Zea Longa 法對(duì)造模成功的大鼠6 h、1 d、2 d、3 d和7 d后的神經(jīng)功能評(píng)價(jià)。無(wú)神經(jīng)功能障礙，活動(dòng)正常為0分;提尾部時(shí)不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分；爬行時(shí)向損傷側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分;爬行時(shí)向?qū)?cè)傾倒為3分;無(wú)法活動(dòng)或意識(shí)不清為4分。

3.3TTC法測(cè)定腦梗死體積 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭處死大鼠，分離腦組織，-20 ℃冰凍30 min，連續(xù)制作2 mm厚度冠狀面5片切片。將腦組織切片立即懸置于2% TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min。隨后置于4%多聚甲醛溶液浸泡固定2 h。梗死區(qū)呈白色，正常區(qū)呈玫瑰紅色。應(yīng)用病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)測(cè)出腦梗塞體積百分比。

3.4腦組織含水量 大鼠斷頭取全腦，采用電子天平精密稱量濕重；置全腦于組織真空烘箱，烘至恒重，電子天平精密稱量干重。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/ 濕重×100%。

3.5RT-qPCR檢測(cè)AQP4和Aβ mRNA的相對(duì)表達(dá)量 取梗塞區(qū)腦組織約100 mg，參照TRIzol說(shuō)明書(shū)采取一步法提取總RNA,檢測(cè)樣本中 RNA 純度合格，然后反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。以cDNA為模板，用ABI 7500 Fast型real-time PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AQP4的正向引物序列為5’-GTGCTAGGAAACTGATATG-3’，反向引物序列為5’-TCTGGTGTAGTACATTCAA-3’；Aβ的正向引物序列為5’-CGGGATCCGATGCAGAATTCCGACATGACTCAG-3’，反向引物序列為5’-ACGCGTCGACCTACGCTATGCAACACCGCCCA-3’； GAPDH 的正向引物序列為5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’，反向引物序列為5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’。 反應(yīng)條件：先用95 ℃孵育5 min;進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s)。GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

3.6Western blot實(shí)驗(yàn) 冰上裂解梗死區(qū)組織勻漿后，12 000×g離心10 min，吸取上清液，萃取總蛋白，用 BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)蛋白含量。蛋白煮沸變性后，上樣60 μg，進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉。室溫孵育 I 抗AQP4(1∶2 000)、Aβ(1∶1 000)和GAPDH(1∶4 000) 2 h后，用TBST洗3次,每次5 min；孵育對(duì)應(yīng)的 II 抗1.5 h，用TBST洗3次,每次10 min。使用避光ECL顯色檢測(cè)蛋白條帶。以Quantity One 軟件進(jìn)行圖像灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參照，校正各組Aβ和AQP4的灰度值。

3.7明膠酶譜檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)和MMP9的活性 冰上裂解梗死區(qū)組織勻漿后，12 000×g離心10 min，吸取上清液，萃取總蛋白，用 BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。按照基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2/9)明膠酶譜法試劑盒說(shuō)明操作。蛋白直接上樣60 μg，進(jìn)行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后，將凝膠置于洗脫液洗3次,每次10 min，將凝膠置于孵育液中，37 ℃孵育6 h；孵育結(jié)束后，經(jīng)0.05%考馬斯亮藍(lán)染色2 h，然后脫色2 h，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析灰度值。

3.8HE染色病理學(xué)觀察 分離梗死區(qū)腦組織，生理鹽水沖洗，將完整腦組織放入4%多聚甲醛中固定。在真空組織脫水機(jī)內(nèi)進(jìn)行梯度乙醇浸潤(rùn)脫水，二甲苯透明處理，置于60 ℃液蠟I、II中分別浸潤(rùn)透蠟1.5 h，包埋后放至冷卻，制成蠟塊置于4 ℃保存片，切片(厚度為4 μm)，蘇木素染色5 min，蒸餾水洗浸泡1 min，1%鹽酸分化45 s，蒸餾水浸泡5 min，伊紅復(fù)染5 min，脫水后，光鏡下觀察病變區(qū)腦組織病理變化。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 16.0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，多組間比較采用單素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較

術(shù)后模型組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分逐漸升高(P<0.05),3 d后再降低(P<0.05)，且在2 d時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分最高(P<0.05)；與模型組相比，依達(dá)拉奉預(yù)處理組的神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(P<0.05)，且高劑量組降低最明顯(P<0.05),見(jiàn)圖1。

Figure 1.The neurological function scores of different groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

圖1各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

2 各組大鼠腦組織含水量的比較

術(shù)后模型組大鼠的腦組織含水量變化的差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與模型組相比，依達(dá)拉奉預(yù)處理能明顯預(yù)防腦水腫(P<0.05)；相對(duì)于低劑量組，高劑量組在術(shù)后1～3 d的腦組織含水量明顯降低(P<0.05)，而術(shù)后7 d的差異差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見(jiàn)圖2。

Figure 2.The brain water content in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

圖2各組大鼠腦組織含水量

3 各組大鼠腦梗死體積的比較

術(shù)后模型組大鼠的腦梗死體積逐漸升高(P<0.05),后稍微降低(P<0.05)，且在術(shù)后2 d梗死體積最高(P<0.05)；與模型組相比，依達(dá)拉奉預(yù)處理組的腦梗死體積明顯降低(P<0.05)，且高劑量組降低最明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 各組大鼠腦組織病理形態(tài)的比較

假手術(shù)組未見(jiàn)明顯變化；術(shù)后模型組大鼠的腦梗死區(qū)出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，腦組織水腫十分明顯，且在術(shù)后2 d出現(xiàn)大量白細(xì)胞浸潤(rùn)，術(shù)后7 d癥狀有所減輕；與模型組相比，依達(dá)拉奉預(yù)處理組的腦梗死白細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，且高劑量組在術(shù)后7 d，白細(xì)胞浸潤(rùn)基本消失，見(jiàn)圖4。

5 各組大鼠腦梗死區(qū)組織AQP4 和Aβ mRNA水平的比較

術(shù)后1 d和2 d，與假手術(shù)組相比，模型組AQP4和Aβ的mRNA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，依達(dá)拉奉預(yù)處理組AQP4和Aβ的mRNA水平明顯降低(P<0.05)，且高劑量組降低最明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1。

Figure 3.Typical macrographs of TTC staining in different groups. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

圖3各組大鼠腦組織的TTC染色觀察

Figure 4.Typical histological images with HE staining of different groups (×200).

圖4各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果

表1各組大鼠腦梗死區(qū)AQP4和AβmRNA水平的比較

Table 1.The mRNA levels of AQP4 and Aβ in different groups (Mean±SD.n=5)

TimeGroupAQP4Aβ 1 dSham0.053±0.0110.321±0.046Model0.139±0.028*1.385±0.115*Low dose0.104±0.020*#0.984±0.097*#High dose0.081±0.017*#&0.752±0.095*#&2 dSham0.052±0.0130.328±0.056Model0.154±0.029*1.785±0.216*Low dose0.091±0.020*#0.873±0.089*#High dose0.072±0.013*#&0.564±0.086*#&

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

6 各組大鼠腦組織中AQP4和Aβ蛋白水平的比較

術(shù)后1 d和2 d，與假手術(shù)組相比，模型組的AQP4蛋白和Aβ 蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，依達(dá)拉奉預(yù)處理組的AQP4蛋白和Aβ 蛋白水平明顯降低(P<0.05)，且高劑量組降低最明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

7 各組大鼠腦組織中MMP2和MMP9活性的比較

術(shù)后1 d和2 d，與假手術(shù)組相比，模型組的MMP2和MMP9活性明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，依達(dá)拉奉預(yù)處理組的MMP2和MMP9活性明顯降低(P<0.05)，且高劑量組降低最明顯(P<0.05)，見(jiàn)表2。

Figure 5.The protein levels of AQP4 and Aβ in different group. A: 1 d after operation; B: 2 d after operation. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

圖5各組大鼠的腦梗死區(qū)中AQP4蛋白和Aβ蛋白水平的比較

表2各組大鼠腦梗死區(qū)MMP2和MMP9活性的比較

Table 2.The activity of MMP2 and MMP9 in different groups (Mean±SD.n=5)

TimeGroupMMP2MMP9 1 dSham1.603±0.0210.819±0.064Model2.792±0.068*2.116±0.132*Low dose2.533±0.084*#1.842±0.090*#High dose2.194±0.076*#&1.494±0.078*#& 2 dSham1.608±0.0250.817±0.052Model2.524±0.087*2.032±0.118*Low dose2.108±0.095*#1.436±0.076*#High dose1.842±0.091*#&1.152±0.061*#&

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

討 論

急性缺血性腦卒是人類死因排名第2位的腦血管疾病，具有高死亡率和高致殘率，且其發(fā)病呈逐年升高的態(tài)勢(shì)[1-2]。而對(duì)于AIS的治療是及早恢復(fù)腦組織血液灌注，而血液恢復(fù)灌注極易出現(xiàn)I/R損傷[4]。腦I/R損傷不僅能產(chǎn)生過(guò)度自由基，還能導(dǎo)致腦水腫發(fā)生[8-9],而腦水腫不僅是腦I/R損傷的病理生理機(jī)制之一，而且與患者病情進(jìn)程相關(guān)，腦水腫機(jī)械占位損傷和繼發(fā)性損傷是引起患者死亡的主要原因[9-10]。AQP4作為一種雙向水轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白，與腦水腫的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，是腦水腫形成以及消退的重要分子[11-12]，早期AIS出現(xiàn)細(xì)胞毒性腦水腫，且伴隨輕度血管源性腦水腫，后者可導(dǎo)致腦中風(fēng)患者病情加重以及惡化，甚至引起患者死亡，因此是否能有效控制腦水腫是治療的關(guān)鍵[13]。依達(dá)拉奉具有減輕腦水腫、減輕腦組織缺血再灌注損傷，保護(hù)腦組織及改善預(yù)后的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉預(yù)處理能有效降低急性腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，神經(jīng)功能障礙；且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉預(yù)處理能有效降低腦組織含水量，減輕腦水腫；對(duì)腦梗死區(qū)腦組織AQP-1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉預(yù)處理能有效降低腦組織AQP-1 的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)AIS的發(fā)生與Aβ沉積相關(guān)[15]。在AIS早期Aβ沉積與炎癥因子存在相互促進(jìn)關(guān)系，腦I/R損傷產(chǎn)生過(guò)度自由基，介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)促使炎癥因子快速釋放，導(dǎo)致Aβ沉積，后者又促使炎癥因子級(jí)聯(lián)放大，加重神經(jīng)組織損傷[16]，且Aβ沉積能導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，又進(jìn)一步導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，急性腦缺血/再灌注大鼠術(shù)后1 d和2 d腦組織Aβ mRNA和蛋白水平明顯升高，依達(dá)拉奉預(yù)處理能有效降低急性腦缺血/再灌注大鼠腦組織Aβ蛋白沉積；進(jìn)一步通過(guò)HE染色觀察腦組織病理結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示依達(dá)拉奉預(yù)處理能有效降低白細(xì)胞侵潤(rùn)，減輕組織學(xué)損傷。

有研究證明，MMP2和MMP9在星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中至關(guān)重要，二者水平含量的升高可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫[18]。因此本文對(duì)比考察各組二者的水平，結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉預(yù)處理能有效降低急性腦缺血/再灌注大鼠腦組織MMP2和MMP9活性，提示依達(dá)拉奉可抑制MMP2和MMP9的活性，改善急性腦缺血/再灌注預(yù)后。

綜上所述，本文通過(guò)研究依達(dá)拉奉能顯著降低急性腦缺血/再灌注大鼠AQP4和Aβ的mRNA和蛋白水平，抑制MMP-2和MMP-9活性，進(jìn)而抑制神經(jīng)功能障礙、腦組織學(xué)損傷和腦水腫，但具體機(jī)制仍需作進(jìn)一步研究。