胡晶晶， 張玉潔， 李榮巧， 梁泰剛， 楊彩紅， 李青山△

(山西醫(yī)科大學(xué) 1藥學(xué)院， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山西 太原 030001)

由于心腦血管疾病具有較高的死亡率和致殘率，近年來對心腦血管疾病的治療引發(fā)了更多的關(guān)注。硝苯地平(nifedipine)作為第一代鈣拮抗劑，是治療心血管疾病高血壓、頑固性充血性心力衰竭和心絞痛的一線藥。目前認為硝苯地平的主要作用機制是阻止鈣內(nèi)流，抑制血管、支氣管和子宮平滑肌的興奮-收縮偶聯(lián)，產(chǎn)生松弛血管平滑肌，擴張冠狀動脈、周圍小動脈及降低外周血管阻力[1]。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)及Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase，ROCK)作為治療心血管疾病的新靶點，均屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內(nèi)很重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。迄今為止，已從哺乳動物中分離出至少12種PKC亞型和20余種Rho家族成員。PKC及ROCK通常以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中，當(dāng)其激活后從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞膜，并經(jīng)歷一系列復(fù)雜的磷酸化過程引發(fā)相應(yīng)的生物學(xué)功能改變，參與多種生理和病理過程。活化后的PKC及ROCK參與肌動蛋白骨架的調(diào)節(jié)和平滑肌細胞收縮等細胞活動，其高表達和異?；罨c許多心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，如高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭和肺動脈高壓等[2-3]。PKC及ROCK作為治療心血管疾病的靶點其活性狀態(tài)是否會影響硝苯地平的舒張血管作用目前還不清楚，因此，本課題在大鼠離體血管環(huán)上研究PKC和ROCK是否與硝苯地平舒血管作用有關(guān)。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1實驗儀器與設(shè)備 八通道離體組織器官恒溫灌流裝置(成都泰盟科技有限公司)；高靈敏度張力傳感器及PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(埃德儀器國際貿(mào)易有限公司)；HH-601超級恒溫水浴(常州市頂新實驗儀器有限公司)；電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；PHS-3C型pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

1.2實驗動物 SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠，體重均為250～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SYXK(晉)2015-0001。動物飼養(yǎng)條件為溫度(22±2)℃，濕度45%～60%，自由攝食及飲水。

1.3實驗試劑 苯腎上腺素(phenylephrine，PE)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、氯化鋇(barium chloride，BaCl2)、四乙胺(tetraethylammonium，TEA)、4-氨基吡啶(4- aminopyridine，4-AP)、格列本脲(glibenclamide，Gli)、星孢菌素(staurosporine,STA)、佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、法舒地爾(fasudil)、血管緊張素 II(angiotensin II，Ang-II)和硝苯地平均購自Sigma。其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1大鼠主動脈血管環(huán)的制備[4]大鼠斷頭處死后，迅速游離主動脈，置于4 ℃、100% O2飽和的生理鹽溶液(physiologic salt solution, PSS)中，將分離干凈的血管剪成3～4 mm的分段血管環(huán)，用2個三角型掛鉤貫穿血管環(huán)管腔，將其水平置于10 mL浴槽中，浴槽內(nèi)裝有5 mL PSS溶液，37 ℃恒溫，并持續(xù)通以100%的O2，下端固定，上端連于張力傳感器，PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)記錄血管張力變化。將基礎(chǔ)張力調(diào)至2 g左右，浴槽內(nèi)每隔15 min換PSS 1次，平衡1 h。制備去內(nèi)皮血管環(huán)時，使用與主動脈內(nèi)徑相當(dāng)?shù)拿薨舸┤胙軆?nèi)摩擦其內(nèi)壁2次，以求完全去除血管內(nèi)皮細胞。

2.2血管環(huán)內(nèi)皮功能的檢測 用60 mmol/L的KCl預(yù)收縮血管環(huán)2次，以誘發(fā)血管的最大收縮幅度，待血管穩(wěn)定達到坪值后(即連續(xù)2次同樣的刺激所引起的收縮幅度差別小于5%)，加入PE(10-6mol/L)使血管收縮，穩(wěn)定后，加入ACh(10-5mol/L)，觀察血管的舒張情況來檢驗內(nèi)皮完整性。以PE刺激收縮后的穩(wěn)定張力為100%，最大舒張幅度大于70%的血管環(huán)即認為血管內(nèi)皮完整，最大舒張幅度小于5%的血管環(huán)即認為血管內(nèi)皮已去除完全。

2.3硝苯地平對大鼠主動脈環(huán)基礎(chǔ)張力的影響 基礎(chǔ)狀態(tài)大鼠胸主動脈環(huán)用PSS平衡1 h，后加入累積濃度(10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L)的硝苯地平或等體積溶劑，觀察血管張力變化。

2.4硝苯地平對內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組主動脈環(huán)張力的影響 血管環(huán)穩(wěn)定后，內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的大鼠胸主動脈環(huán)分別經(jīng)NE(10-6mol/L)和KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮，張力平衡后，實驗組加入累積濃度的硝苯地平，對照組加入等體積溶劑，以分別加入NE和KCl誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度為100%，計算施加硝苯地平后血管舒張幅度占最大收縮幅度的百分比，建立濃度-效應(yīng)曲線。

2.5不同K+通道阻斷劑、PKC阻滯劑/激動劑和ROCK阻滯劑/激動劑對硝苯地平舒張血管作用的影響 血管環(huán)穩(wěn)定后，分別使用不同的工具藥孵育30 min，用NE和KCl預(yù)收縮血管，張力平衡后，加入累積濃度的硝苯地平，對照組為不加工具藥直接加入累積濃度的硝苯地平，記錄相應(yīng)血管環(huán)張力并計算變化值。

2.6硝苯地平對CaCl2量效曲線的影響[5]血管環(huán)穩(wěn)定后，用無鈣含EGTA的PSS沖洗20 min，后將浴液更換為無鈣不含EGTA的生理鹽溶液，10 min后，更換為含KCl(60 mmol/L)無鈣的生理鹽溶液5 mL，預(yù)孵10 min，加入累積濃度(0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、1 mmol/L、3 mmol/L和10 mmol/L)的CaC12，觀察血管環(huán)張力變化。給藥組在加CaC12前10 min加入不同濃度(10-9mol/L、5×10-8mol/L、10-6mol/L)的硝苯地平，空白對照組同時加入溶劑。以空白對照組累計加入CaCl2(10 mmol/L)后引起的收縮張力最大值為100%，建立濃度-效應(yīng)曲線。

2.7硝苯地平對內(nèi)鈣釋放引起血管收縮的影響 血管環(huán)穩(wěn)定后，用無鈣含EGTA的生理鹽溶液沖洗，20 min后，將浴液更換為無鈣不含EGTA的生理鹽溶液，10 min后，實驗組分別加入硝苯地平(10-9mol/L、5×10-8mol/L、10-6mol/L)孵育20 min后，加入NE，空白對照組同時加入等量溶劑，觀察血管的收縮情況。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示。采用GraphPad Prism 6 作濃度-舒張效應(yīng)曲線，多組間比較釆用one-way ANOVA，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 硝苯地平對基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)張力的影響

累積濃度硝苯地平對基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)張力無明顯影響,實驗組與溶劑組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1。

Figure 1.The effect of nifedipine on basic tension of aortic rings. Mean±SD.n=6.

圖1硝苯地平對基礎(chǔ)狀態(tài)主動脈張力的影響

2 硝苯地平對NE/KCl預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響

在NE(10-6mol/L)/KCl(60 mmol/L)誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)中，累積濃度硝苯地平對內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組的主動脈血管環(huán)均有濃度依賴性舒張作用。內(nèi)皮完整組最高累積濃度硝苯地平對血管環(huán)舒張百分比可達(96.47±6.00)% 和(97.84±2.78)%，去內(nèi)皮組中的舒張百分比為(94.87±4.28)%和(98.44±1.06)%，兩組數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2.The relaxation effect of nifedipine on endothelium-intact (E+) and endothelium-denuded (E-) aortic rings precontracted with 10-6mol/L NE (A) or 60 mmol/L KCl (B). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsvehicle group.

圖2硝苯地平對NE和KCl預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響

3 K+通道阻斷劑對硝苯地平舒張血管作用的影響

預(yù)孵Kir通道阻斷劑BaCl2(10-4mol/L)、KCa通道阻滯劑TEA(10-3mol/L)、KATP通道阻斷劑Gli(10-5mol/L)和KV通道阻斷劑4-AP(10-3mol/L)，在NE(10-6mol/L)誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)中，最高累積濃度硝苯地平對血管環(huán)舒張百分比分別為(93.19±1.88)%、(97.05±1.86)%、(95.84±2.68)%和(94.77±2.39)%，與未加阻斷劑的硝苯地平組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性；在KCl(60 mmol/L)誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)中，最高累積濃度硝苯地平的最大舒張率分別為(95.04±3.79)%、(98.29±2.32)%、(98.29±2.32)%和(98.74±0.76)%，與未加阻斷劑的硝苯地平組比較，差異亦均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3.The effects of pretreatment with BaCl2(10-4mol/L), TEA (10-3mol/L), Gli (10-5mol/L) and 4-AP (10-3mol/L) on the vasodilation effect of nifedipine in endothelium-intact aortic rings contracted by 10-6mol/L NE (A) or 60 mmol/L KCl (B). Mean±SD.n=6.

圖3鉀通道阻斷劑對硝苯地平舒張血管作用的影響

4 PKC對硝苯地平舒張血管作用的影響

在NE(10-6mol/L)/KCl(60 mmol/L)誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)中，使用PKC抑制劑STA(10-8mol/L)后，最高累積濃度硝苯地平作用增強對血管環(huán)舒張百分比可達(101.99±0.81)%和(112.04±4.05)%，而PKC激動劑PMA(10-7mol/L)則能減弱硝苯地平對血管的舒張作用，最高累積濃度硝苯地平對血管環(huán)舒張百分比降低為(61.38±8.15)%和(84.92±2.65)%，與硝苯地平組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The effects of pretreatment with STA (10-8mol/L) and PMA (10-7mol/L) on the vasodilation effect of nifedipine in endothelium-intact aortic rings contracted by 10-6mol/L NE (A) or 60 mmol/L KCl (B). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsnifedipine group.

圖4PKC對硝苯地平舒張血管作用的影響

5 ROCK對硝苯地平舒張血管作用的影響

在NE(10-6mol/L)/ KCl(60 mmol/L)誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)中，ROCK抑制劑fasudil(10-6mol/L)能增強硝苯地平對血管的舒張作用，使用后最高累積濃度硝苯地平對血管環(huán)舒張百分比可達(103.67±2.36)%和(100.22±4.12)%，其激動劑Ang-II(10-9mol/L)則能降低硝苯地平對血管的舒張作用，其最大舒張率分別為(63.34±4.35)%和(70.61±3.17)%,與硝苯地平組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

6 硝苯地平對CaCl2量效曲線的影響

在含KCl(60 mmol/L)的無鈣生理鹽溶液中累計加入CaCl2，得到CaCl2的量效曲線。實驗組預(yù)先用硝苯地平(10-9mol/L、5×10-8mol/L和10-6mol/L)分別預(yù)孵可濃度依賴性地減弱CaCl2對血管環(huán)的收縮效應(yīng)，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖6。

Figure 5.The effects of pretreatment with fasudil (10-6mol/L) and Ang-II (10-9mol/L) on the vasodilation effect of nifedipine in endothelium-intact aortic rings contracted by 10-6mol/L NE (A) or 60 mmol/L KCl (B). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsnifedipine group.

圖5ROCK對硝苯地平舒張血管作用的影響

Figure 6.Inhibitory effect of nifedipine (10-9mol/L, 5×10-8mol/L and 10-6mol/L) on the contraction curves dependent on extracellular Ca2+addition (0.1～10 mmol/L) in endothelium-denuded, KCl-stimulated aortic ring preparations incubated in the Ca2+-free medium. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖6硝苯地平對CaCl2量效曲線的影響

7 硝苯地平對內(nèi)鈣釋放引起血管收縮的影響

在無鈣生理鹽溶液中，用硝苯地平(10-9mol/L、5×10-8mol/L和10-6mol/L)預(yù)處理不能減弱NE對血管的收縮作用，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖7。

討 論

PKC和ROCK作為細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，與許多心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，如高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭、肺動脈高壓等[6-7]。目前認為這2種激酶在心血管系統(tǒng)的多種作用，是治療心血管管疾病的新靶點。硝苯地平可用于多種疾病，如高血壓、心絞痛、心肌梗塞、充血性心力衰竭等心血管疾病，也可用于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)疾病[1,8]。本實驗旨在研究PKC及ROCK作為心血管疾病的治療靶點，其活性是否會影響硝苯地平對血管的舒張作用。

Figure 7.The effects of nifedipine (10-9mol/L, 5×10-8mol/L and 10-6mol/L) on contraction via NE (10-6mol/L) in Ca2+-free solution. Mean±SD.n=6.

圖7硝苯地平對內(nèi)鈣釋放的影響

研究發(fā)現(xiàn)，PKC與ROCK共存于同一細胞內(nèi)信號通路，且在ROCK上游發(fā)揮作用[9]。ROCK的經(jīng)典底物是肌球蛋白輕鏈20(myosin light chain 20，MLC20)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)，它們是參與細胞舒縮運動的重要蛋白分子。在血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)中，ROCK能夠直接激活MLC20，也能抑制MLCP的活性，間接增加MLC20磷酸化水平，進而使VSMCs收縮[10]。本研究結(jié)果顯示，ROCK抑制劑fasudil(10-6mol/L)及PKC抑制劑STA(10-8mol/L)可以明顯增大硝苯地平的舒血管作用，表明ROCK和PKC可能協(xié)同介導(dǎo)血管收縮作用；而預(yù)孵ROCK激動劑Ang-II(10-9mol/L)及PKC激動劑PMA(10-7mol/L)能夠使硝苯地平的舒血管作用減弱，表明硝苯地平的舒張血管作用可能與抑制PKC-ROCK信號通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，平滑肌所特有的分子量17 kD的PKC增強蛋白磷酸酶1抑制物(PKC-potentiated protein phosphatase 1 inhibitor of 17 kD，CPI-17)也是ROCK的重要底物之一，活化狀態(tài)的ROCK能磷酸化CPI-17，后者與MLCP結(jié)合，掩蓋MLCP的靶亞基1從而抑制MLCP的活性，促進平滑肌細胞的收縮，這種收縮與Ca2+濃度無關(guān)，為鈣非依賴性調(diào)節(jié)，即Ca2+敏化過程[11]。由PKC介導(dǎo)的Ca2+增敏機制也不依賴于Ca2+的內(nèi)流[12]。PKC主要通過直接激活MLCK及ROCK參與血管的收縮反應(yīng)，CPI-17作為鈣離子敏感性的潛在介質(zhì)，亦能被PKC磷酸化，進而抑制MLCP的活性，間接增加MLC20的磷酸化水平，進而促進血管收縮。也就是說CPI-17作為ROCK和PKC的共同底物參與激動劑誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞收縮，與鈣敏感性有關(guān)[13]。ROCK激動劑Ang-II(10-9mol/L)及PKC激動劑PMA(10-7mol/L)能夠使硝苯地平的舒血管作用減弱，可能干擾了ROCK及PKC介導(dǎo)的收縮蛋白對Ca2+增敏的過程。

血管的舒張不僅與PKC、ROCK等信號密切相關(guān)，也與血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌上的鉀通道、鈣通道等密切相關(guān)，為排除相關(guān)因素的影響，我們進一步研究了硝苯地平對內(nèi)皮、離子通道的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硝苯地平對基礎(chǔ)狀態(tài)下血管環(huán)的靜息張力無明顯作用，對KCl及NE預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)具有明顯的舒張作用，且呈濃度依賴性，內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組比較無明顯差異。因此，硝苯地平對血管的舒張作用可能與血管內(nèi)皮細胞無關(guān)，而是直接作用于血管平滑肌。

血管平滑肌的舒縮活動跟其上的鉀通道活性密切相關(guān)，鉀通道活性的改變可引起血管平滑肌細胞膜電位的去極化或超極化，從而改變VSMCs的膜電位及興奮性[14-15]。為排除鉀通道在硝苯地平舒血管中的作用，我們使用了Kir阻斷劑(BaCl2，10-4mol/L)、 KCa阻斷劑(TEA，10-3mol/L)、 KATP阻斷劑(Gli，10-5mol/L)和KV阻斷劑(4-AP，10-3mol/L)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均不能抑制硝苯地平的舒張血管作用，提示硝苯地平的舒血管作用可能與4種鉀通道無關(guān)。

血管平滑肌上的電壓依賴性鈣通道和受體操縱性鈣通道，可分別被高鉀和NE激活。在無鈣環(huán)境中，用高濃度的KCl使血管去極化，硝苯地平能夠濃度依賴性地抑制該情況下由CaCl2引起的血管收縮。由此表明，硝苯地平可以抑制Ca2+通過電壓依賴鈣通道內(nèi)流，從而使細胞內(nèi)Ca2+濃度降低，進而引起血管舒張。在無鈣的生理鹽溶液中，用硝苯地平預(yù)處理不能減弱NE對血管的收縮作用，而在有鈣的環(huán)境下硝苯地平能夠明顯抑制NE刺激主動脈環(huán)引起的收縮，表明硝苯地平可拮抗外鈣內(nèi)流，介導(dǎo)其對血管的舒張作用，其舒張血管的作用與內(nèi)鈣釋放無關(guān)。