阮水良， 韓晨陽(yáng)， 官俏兵， 楊 毅

(嘉興市第二醫(yī)院， 浙江 嘉興 314001)

胃癌是中國(guó)人群常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。慢性胃炎是胃癌發(fā)生的高危因素，使用常規(guī)的非甾體抗炎藥和靶向干擾炎癥的藥物可以抑制胃癌的發(fā)生和發(fā)展[1]。白細(xì)胞介素9(interleukin-9, IL-9)是由輔助性T細(xì)胞Th9分泌的一種多功能的細(xì)胞因子，其與受體結(jié)合后促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，作用于炎癥細(xì)胞和組織細(xì)胞，目前發(fā)現(xiàn)IL-9可以激發(fā)促炎因子并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[2]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)指的是由上皮到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，在腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，EMT的發(fā)生可以賦予腫瘤細(xì)胞極強(qiáng)的侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力，是腫瘤轉(zhuǎn)移不可缺少的過(guò)程[3-4]。在胃癌的發(fā)生發(fā)展研究中發(fā)現(xiàn)，慢性胃炎及胃潰瘍是胃癌發(fā)生的高危因素，而IL-9在胃炎的發(fā)生以及維持中具有重要的作用。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-9在胃癌中存在高表達(dá)，但是IL-9是否可以促進(jìn)胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，尚未見(jiàn)明確的報(bào)道 ，鑒于IL-9在胃癌中的高表達(dá)，而人胃癌MKN-45細(xì)胞屬于低分化高轉(zhuǎn)移性的胃癌細(xì)胞，適合用于胃癌細(xì)胞侵襲的研究，因此本文主要研究IL-9促進(jìn)胃癌細(xì)胞MKN-45轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和試劑

MKN-45細(xì)胞和RPMI-1640完全培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)；重組人白細(xì)胞介素9(武漢艾美捷科技有限公司)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；抗E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白(vimentin)、fibronectin、collagen I、Snail、Slug、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Smad3、Smad5抗體及HRP標(biāo)記的 II 抗(Cell Signaling Technology)；Transwell小室(北京萌壯科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR Green SuperMix試劑盒(Thermo Fisher Scientific)。引物由大連寶生物技術(shù)公司合成。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組 MKN-45細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后分為對(duì)照組(control)和IL-9組，其中對(duì)照組不做任何處理，采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；IL-9組使用終濃度為100 ng/L的IL-9干預(yù)。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞(1×107/L)于96孔板中培養(yǎng)，貼壁后進(jìn)行分組，其中對(duì)照組使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，IL-9組使用終濃度為100 ng/L的IL-9的干預(yù)，設(shè)置空白對(duì)照，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后使用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的活力。

2.3Transwell法測(cè)定細(xì)胞侵襲能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(1×109/L)加入Transwell小室，24孔板下室加入完全培養(yǎng)基，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，IL-9組上室用100 ng/L IL-9干預(yù)，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)胞貼壁情況，待完全貼壁后取出小室，棄去培養(yǎng)基，甲醇固定后用0.1%的結(jié)晶紫染色，棉簽擦去上層未遷移的細(xì)胞后鏡下觀察。

2.4免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞中vimentin蛋白的表達(dá) 取1×1010/L的細(xì)胞接種于無(wú)菌玻璃蓋破片上培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)的細(xì)胞使用4%多聚甲醛室溫固定15 min，之后使用100%冰甲醇于-20 ℃通透化10 min。將細(xì)胞置于5%牛血清白蛋白溶液中封閉1 h并加入相應(yīng)的 I 抗于4 ℃孵育過(guò)夜。 I 抗處理后使用相應(yīng)的 II 抗于室溫下孵育2 h并利用熒光顯微鏡(×400)進(jìn)行觀察。

2.5Western blot法檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平 使用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，加入適量的細(xì)胞裂解液[20 mmol/L Tris (pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、2 mmol/L EGTA、1 mmol/L sodium orthovanadate、50 mmol/L sodium fluoride、1% Triton X-100、0.1% SDS和100 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride]于冰上裂解30 min。裂解后于4 ℃、12 000×g離心20 min并收集上清。蛋白電泳使用10% SDS-PAGE分離，之后將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，使用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后分別加入 I 抗與 II 抗孵育后，顯色。

2.6RT-qPCR檢測(cè)相應(yīng)mRNA的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分為對(duì)照組和IL-9組，干預(yù)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入TRIzol試劑，裂解細(xì)胞后移入EP管，室溫中放置2 min，加入三氯乙烷振蕩后12 000×g在4 ℃離心15 min，棄去上清液后加入1 mL的75%乙醇，7 500×g4 ℃離心15 min，得到總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取上述得到的1 μL cDNA為模板，按照試劑盒加入SYBR Green Mix，引物后進(jìn)行qPCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)變性15 min; 94 ℃變性20 s、56 ℃退火30 s、68 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件包進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IL-9對(duì)MKN-45細(xì)胞活力的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，干預(yù)24 h后對(duì)照組和IL-9組細(xì)胞存活率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；48 h和72 h的結(jié)果顯示，IL-9可以提高M(jìn)KN-45細(xì)胞的存活率(P<0.05)，見(jiàn)圖 1。

表1 RT-qPCR用引物序列

Figure 1.The effect of IL-9 on the viability of the MKN-45 cells measured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1IL-9對(duì)MKN-45細(xì)胞存活率的影響

2 IL-9對(duì)MKN-45細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，當(dāng)IL-9干預(yù)24 h后，IL-9組的細(xì)胞侵襲能力相比對(duì)照組顯著增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

3 IL-9對(duì)MKN-45細(xì)胞波形蛋白蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，未經(jīng)過(guò)IL-9刺激時(shí)MKN-45細(xì)胞中的波形蛋白幾乎不表達(dá)，而IL-9干預(yù)后vi-mentin表達(dá)顯著增多，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The effect of IL-9 on the invasion ability of the MKN-45 cells detected by Transwell assay with crystal violet staining (×200). Mean±SD.*P<0.05vscontrol group.

圖2Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化

Figure 3.The effect of IL-9 on the protein expression of vimentin in the MKN-45 cells observed by the method of immunofluorescence (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3免疫熒光法觀察vimentin蛋白表達(dá)的變化

4 遷移運(yùn)動(dòng)細(xì)胞形態(tài)的變化

將細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%密度后進(jìn)行劃痕，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，鏡下觀察遷移運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞形態(tài)的變化，對(duì)照組細(xì)胞為成規(guī)培養(yǎng)的圓形細(xì)胞，梭形變化不明顯，而IL-9組的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的梭形變化,見(jiàn)圖4。

Figure 4.The morphological changes of the migrating MKN-45 cells treated with IL-9 (×400).

圖4遷移運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞形態(tài)的變化

5 Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

在IL-9干預(yù)24 h后，提取總蛋白進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,N-cadherin、fibronectin、collagen I和vimentin表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，而核心轉(zhuǎn)錄因子Snail與Slug的表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖5、6。

Figure 5.The effects of IL-9 on the expression of EMT-related proteins in the MKN-45 cells determined by Western blot. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖5Westernblot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

Figure 6.The effects of IL-9 on the protein expression of key transcription factors Snail and Slug in the MKN-45 cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖6Westernblot檢測(cè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail與Slug表達(dá)的變化

6 Western blot檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

在IL-9干預(yù)24 h后，提取總蛋白進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，TGF-β及其下游的關(guān)鍵受體Smad3和Smad5的蛋白表達(dá)水平顯著增高，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

7 EMT相關(guān)蛋白及TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA表達(dá)

在IL-9作用下，MKN-45細(xì)胞的EMT關(guān)鍵分子N-cadherin、fibronectin、collagen I和vimentin的mRNA表達(dá)上調(diào)，E-cadherin的mRNA表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，而核心轉(zhuǎn)錄因子Snail與Slug的mRNA表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)分子TGF-β及其下游的關(guān)鍵受體Smad3和Smad5的mRNA表達(dá)顯著增高，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見(jiàn)圖8。

討 論

EMT是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)生過(guò)程中的基礎(chǔ)過(guò)程，在胚胎的早期較為多見(jiàn)，也存在于許多慢性病和腫瘤的發(fā)生過(guò)程中[5],它是上皮細(xì)胞間的黏附結(jié)構(gòu)、極性以及細(xì)胞骨架的改變，許多證據(jù)證明它在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中有著重要的作用[6]。EMT發(fā)生的過(guò)程中細(xì)胞間的極性和緊密連接發(fā)生變化，與相鄰細(xì)胞的分離，遷移到鄰近的組織，其中主要的分子特征是鈣黏蛋白的變化，例如E-cadherin、角質(zhì)蛋白的表達(dá)下降[7]，N-cadherin和vimentin的表達(dá)上調(diào)等[8-9]。一旦腫瘤發(fā)生了轉(zhuǎn)移，在微環(huán)境的作用下，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞還可以再分化。鈣黏素是一種依賴(lài)鈣離子的細(xì)胞間黏連的糖蛋白分子，主要有E、P和N 3種，在EMT中E-cadherin的表達(dá)下調(diào)可以啟動(dòng)EMT的發(fā)生。有研究表明，E-cadherin的表達(dá)下調(diào)水平和腫瘤細(xì)胞的侵襲能力呈現(xiàn)正相關(guān)[7]，而一些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也可以促進(jìn)EMT的發(fā)生。目前研究表明Snail、Slug、ZEB1以及FOXC2等轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)EMT的發(fā)生和發(fā)展[10-11]，且這類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ERK、Smad和PI3K等信號(hào)通路的傳導(dǎo)促進(jìn)EMT的發(fā)生，尤其是Snail和Slug的表達(dá)可以抑制E-cadherin的表達(dá)和緊密連接蛋白的表達(dá)。

Figure 7.The effects of IL-9 on the protein expression of TGF-β/Smad signaling pathway-related molecules in the MKN-45 cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖7Westernblot檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

Figure 8.The effects of IL-9 on the mRNA expression of EMT factors and TGF-β/Smad signaling molecules in the MKN-45 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖8RT-qPCR檢測(cè)EMT關(guān)鍵因子及TGF-β/Smad信號(hào)相關(guān)分子的mRNA表達(dá)

生長(zhǎng)因子可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，例如HGF、EGF、TGF和PDGF等，尤其是TGF信號(hào)可以和膜表面的受體結(jié)合通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)，活化不同的轉(zhuǎn)錄因子。體外實(shí)驗(yàn)證明TGF-β可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生促進(jìn)其轉(zhuǎn)移[12]，Smad作為T(mén)GF-β下游重要的受體，在研究中發(fā)現(xiàn)Smad3的敲除可以抑制EMT的發(fā)生，主要原因是因?yàn)镾mad3的傳導(dǎo)可以激活Snail的表達(dá)[12]，這一點(diǎn)在乳腺癌細(xì)胞MCF7中得到了證實(shí)。目前認(rèn)為T(mén)GF-β介導(dǎo)的EMT主要由Smad3完成，但是也有實(shí)驗(yàn)證明Smad5也可以補(bǔ)給Smad3信號(hào)，當(dāng)Smad3通路受阻礙時(shí)，Smad5可以介導(dǎo)下游信號(hào)[14]。

目前在胃癌的發(fā)生中，大量的實(shí)驗(yàn)證明慢性炎癥以及幽門(mén)螺桿菌感染是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要因素[15]，而IL-9作為T(mén)h9細(xì)胞分泌的關(guān)鍵炎癥因子，在慢性結(jié)腸炎和胃炎發(fā)生中已經(jīng)得到了證實(shí)[16]，也有證據(jù)表明IL-9在胃癌患者組織中存在高表達(dá)[17]，表明IL-9的高表達(dá)可能不僅僅與慢性炎癥有關(guān)還可以與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在以往的研究中發(fā)現(xiàn)TGF-β-Smad信號(hào)與Th9細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-9具有相關(guān)性。TGF-β主要激活naive T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)并誘導(dǎo)Th9細(xì)胞產(chǎn)生，Th9細(xì)胞產(chǎn)生的IL-9可以與Smad信號(hào)中IL-9位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)一步激活下游信號(hào)[18-19]。TGF-β激活smad3和Notch蛋白胞內(nèi)信號(hào)、促進(jìn)重組信號(hào)連接蛋白R(shí)BP-J與IL-9位點(diǎn)的結(jié)合，IL-9與TGF-β信號(hào)也存在反饋性調(diào)節(jié)，高表達(dá)IL-9的同時(shí)可以激活Smad3，從而進(jìn)一步促進(jìn)IL-9與IL-9位點(diǎn)的結(jié)合[20]。從本研究的結(jié)果來(lái)看，MKN-49細(xì)胞經(jīng)過(guò)IL-9干預(yù)后侵襲能力明顯提高，且細(xì)胞形態(tài)由圓形向梭形轉(zhuǎn)化，這提示可能存在EMT的過(guò)程，其中EMT關(guān)鍵的鈣黏蛋白以及纖維連接蛋白的表達(dá)下降，進(jìn)一步說(shuō)明了細(xì)胞黏附能力的下降，EMT的核心轉(zhuǎn)錄因子Snail與Slug的表達(dá)上調(diào)，結(jié)合上述的結(jié)果可以說(shuō)明IL-9的高表達(dá)確實(shí)促進(jìn)了EMT的發(fā)生。在機(jī)制的研究中我們發(fā)現(xiàn)，IL-9干預(yù)后促進(jìn)了TGF-β/Smad信號(hào)的激活，值得注意的是Smad3和Smad5同時(shí)高表達(dá)，說(shuō)明不僅存在Smad3這一條主要的通路，Smad5旁路也被激活，這可能是由于高表達(dá)的IL-9激活了Smad3和Smad5中的IL-9位點(diǎn)，促進(jìn)了IL-9的結(jié)合，而TGFβ信號(hào)上下游蛋白的激活，進(jìn)一步促進(jìn)了EMT的發(fā)生。所以我們有理由相信IL-9促進(jìn)MKN-45細(xì)胞的EMT發(fā)生是與TGF-β/Smad信號(hào)密切相關(guān)的

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-9的高表達(dá)可能促進(jìn)了胃癌細(xì)胞EMT,增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的侵襲能力，所以IL-9不僅僅在炎癥反應(yīng)中有作用，在胃癌中同樣有著重大的作用。這一發(fā)現(xiàn)可以為胃癌的研究提供新的思路。