雷雨廣， 張偉麗， 陳 超， 杜尊國

(1信陽市第二人民醫(yī)院病理科, 2信陽職業(yè)技術學院護理學院， 河南 信陽 464000； 3復旦大學附屬華山醫(yī)院病理科， 上海 200031)

口腔癌是常見的嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。近年來，口腔癌的發(fā)病率和死亡率逐年增加，至今未找到高效的治療方法[1-3]。鱗狀細胞癌占口腔頜面部惡性腫瘤的80%以上，是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤[4],因此本文選用口腔鱗癌細胞進行相關研究。RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術可從源頭上“沉默”機體中的特定致癌基因，從而達到治療腫瘤的作用，為解決口腔癌的臨床治療問題帶來了希望。近年來的研究發(fā)現，缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在多種惡性實體瘤組織中的表達量顯著增加，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和預后等密切相關[5-6]。研究表明，HIF-1α還與腫瘤的惡性程度呈現正相關性，因此普遍認為HIF-1α是一種致癌基因[7]。本實驗檢測了HIF-1α在口腔磷癌細胞以及正?？谇簧掀ぜ毎械谋磉_量，并通過RNAi技術設計靶向沉默HIF-1α的siRNA表達載體，轉染口腔癌細胞，觀察HIF-1α在人口腔鱗癌中表達的變化，并探討其水平的變化對口腔癌細胞活力和凋亡的影響以及作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

正?？谇火つど掀ぜ毎礜OK購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；口腔鱗癌細胞系Tca8113和CAL27購自中科院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基和TRIzol試劑購自Gibco；胎牛血清購自HyClone；逆轉錄試劑盒購自大連TaKaRa；苯甲基磺酰氟(phenyl-methanesulfonyl fluoride，PMSF)和細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司；噻唑藍(methylthiazolyl diphenyltetrazolium bromide，MTT)和二甲基亞砜(di-methyl sulfoxide, DMSO)購自Sigma；Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自Invitrogen；鼠抗人HIF-1α單克隆抗體、β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體、鼠抗人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體和鼠抗人Bax單克隆抗體購自Santa Cruz； 鼠抗人癌胚抗原相關細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecular 1，CEACAM1)單克隆抗體購自Abcam；兔抗人P21單克隆抗體購自Cell Signaling Technology。細胞培養(yǎng)箱和酶標儀購自Thermo；流式細胞儀購自Beckman Coulter；熒光定量PCR儀購自Roche。

2 實驗方法

2.1細胞的培養(yǎng) NOK細胞、Tca8113細胞和CAL27細胞均置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入1%的雙抗，放入37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，待細胞濃度達到90%進行傳代。棄去培養(yǎng)基，加入1 mL胰酶消化約1～2 min，加入2 mL完全培養(yǎng)基，沖洗培養(yǎng)瓶壁上的細胞，離心，棄去上清液，分裝至2個新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2RT-PCR檢測口腔鱗癌細胞以及正常上皮細胞中HIF-1α和CEACAM1的mRNA表達量 收集細胞，加入1 mL TRIzol吹打均勻，冰上裂解5 min，提取細胞總RNA。加入1.0 μL逆轉錄酶，94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，30個循環(huán)，合成cDNA。根據GenBank中基因的序列，由上海生工合成基因引物，HIF-1α上游引物序列為5’-TGCTTGGTGCTGATTTGTGA-3’，下游引物序列為5’-GGTCAGATGATCAGAGTCCA-3’；CEACAM1的上游引物序列為5’-AAGCGACCAGCGTGATCT-3’，下游引物序列為5’-AAAGTTCAGGGTAGAATAAGTAACTTCA-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游引物序列為5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。以cDNA為模板，GAPDH為內參照，反應體系為20 μL，反應條件: 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s, 55 ℃ 10 s, 72 ℃ 15 s， 40個循環(huán)；65 ℃ 5 s, 40 ℃ 10 s。實驗重復3次。

2.3Western blot檢測口腔鱗癌細胞以及正常上皮細胞中HIF-1α和CEACAM1的蛋白表達量 收集5×106個細胞，每孔加入100 μL PMSF細胞裂解液，提取細胞中總蛋白，與等體積2×上樣緩沖液混合均勻，沸水加熱5 min，離心；將玻璃板、梳子清洗干凈，配置10%的分離膠，小心注入玻璃板縫隙中，預留3cm高度的空間，加入去離子水，靜置60 min；制備5%的堆積膠，棄去雙蒸水，晾干，將堆積膠注入分離膠上部，插入梳子，待堆積膠凝固，拔去梳子，置于電泳槽中，加入1×電泳液。吸取20 μL蛋白樣品加入上樣孔，恒壓80 V電泳至溴酚藍到達堆積膠邊緣，調整電壓120 V，直至溴酚藍到達凝膠底部。將PVDF膜一端接正極，凝膠一端接負極，恒定電流280 mA轉膜35 min；加入封閉液，室溫封閉2 h；棄去封閉液，加入 I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入II抗，37 ℃孵育1.5 h，TBST漂洗3次，每次5 min，暗室中顯色，曝光，拍照，Quantity One分析蛋白質灰度值。同法檢測HIF-1α下游P53、P21、VEGF、Bcl-2和Bax蛋白水平的變化。

2.4細胞的轉染 CAL27細胞分為空白對照(blank control)組、無義對照(non-sense control)組和siRNA-HIF-1α組。轉染前24 h，取對數期細胞計數，以每孔2×105個接種于6孔板中，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合率達到40%～50%左右，開始轉染。3條有效siRNA-HIF1α片段由上海吉瑪制藥有限公司合成，實驗前篩選出干擾效果較強的片段，正義鏈為5’-GATCCGAAAGATAGAGCAAGACAATTCA-AGAGATTGTCTTGCTCTATCTTTCTTTTTTGGAAA-3’，反義鏈為5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAAAGATAGAGCAAGACAATCTCTTGAATTGTCTTGCTGTATCTTTGG-3’；無義對照正義鏈為5’-GATCCGTATAAGTCAA-CTGTTGACTTCAAGAGAGTCAACAGTTGACTTATAC-TTTTTTGGAAA-3’，反義鏈為5’-AGCTTTTCCAAAA-AAGTATAAGTCAACTGTTGACTCTTGAAGTCAACAG-TTGACTTATACG-3’。根據脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書將無義對照和siRNA-HIF1α序列分別轉染入CAL27細胞后，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。轉染后，根據2.3所示的方法，用Western blot檢測轉染后細胞中HIF-1α蛋白的表達量。

2.5MTT法檢測細胞的活力 將各組CAL27細胞以每孔1×105接種于96孔板中，每組3個復孔，37 ℃培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)4 h，棄去上清，加入100 μL DMSO，37 ℃搖床中孵育30 min，酶標儀檢測細胞在570 nm的吸光度(A)值，實驗重復3次，取平均值。

2.6流式細胞術檢測細胞的凋亡能力 收集各組細胞，胰酶消化，以結合緩沖液將細胞濃度調整為1×109/L，取100 μL細胞懸浮液加入24孔板中，培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，避光反應15 min，流式細胞術分析細胞的凋亡率。

3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計處理，結果以平均數±標準差(mean±SD)表示，多組數據間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 口腔鱗癌和正?？谇簧掀ぜ毎蠬IF-1α和CEACAM1 mRNA和蛋白表達量的變化

與NOK細胞相比，Tca8113和CAL27細胞HIF-1α的mRNA和蛋白表達量顯著上調(P<0.05)，CEACAM1的mRNA和蛋白水平顯著增加(P<0.05)；與Tca8113細胞相比，CAL27細胞中HIF-1α和CEACAM1的mRNA和蛋白水平顯著增加(P<0.05)，且HIF-1α 與CEACAM1的表達量呈正相關(r2=0.685，P=0.012)，見圖1、表1。這表明HIF-1α和CEACAM1在口腔鱗癌細胞中的表達量顯著高于正常細胞，提示HIF-1α 可能參與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

Figure 1.The images of Western blot for determining the protein expression of HIF-1α and CEACAM1 in the oral squamous cell carcinoma and normal epithelial cells.

圖1Westernblot檢測口腔鱗癌和正?？谇簧掀ぜ毎蠬IF-1α和CEACAM1蛋白的表達量

表1口腔鱗癌和正?？谇簧掀ぜ毎蠬IF-1α和CEACAM1的mRNA和蛋白表達量

Table 1.The expression of HIF-1α and CEACAM1 at mRNA and protein levels in oral squamous cell carcinoma and normal epithelial cells (Mean±SD.n=3)

Cell linemRNA expressionProtein expressionHIF-1α CEACAM1 HIF-1αCEACAM1NOK0.065±0.0080.009±0.0010.124±0.0130.215±0.020Tca81130.123±0.014*0.073±0.008*0.456±0.069*0.436±0.048*CAL270.256±0.027*#0.152±0.017*#0.834±0.085*#0.649±0.067*#

*P<0.05vsNOK;#P<0.05vsTca8113.

2 轉染后CAL27細胞中HIF-1α蛋白水平的變化

以CAL27細胞作為后續(xù)實驗的研究對象，將siRNA-HIF-1α轉染入CAL27細胞，Western blot 檢測細胞中HIF-1α蛋白的表達量，結果顯示,與空白對照組和無義對照組比較，siRNA-HIF-1α組細胞中HIF-1α蛋白的表達量顯著降低(P<0.05)；無義對照組與空白對照組相比細胞中HIF-1α蛋白表達量的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

Figure 2.The protein level of HIF-1α in the cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group.

圖2轉染后細胞中HIF-1α蛋白水平的變化

3 沉默HIF-1α表達對CAL27細胞活力的影響

與空白對照組相比，無義對照組細胞活力的差異無統(tǒng)計學顯著性，siRNA-HIF-1α組細胞活力顯著降低(P<0.05),見圖3。

Figure 3.The effect ofHIF-1αknockdown on the viability of CAL27 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group.

圖3沉默HIF-1α表達對CAL27細胞活力的影響

4 沉默HIF-1α表達對CAL27細胞凋亡的影響

與空白對照組相比，無義對照組的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學顯著性，siRNA-HIF-1α組的細胞凋亡率顯著增加(P<0.05),見圖4。

Figure 4.The effect ofHIF-1αknockdown on the apoptosis of CAL27 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group.

圖4沉默HIF-1α表達對CAL27細胞凋亡的影響

5 沉默HIF-1α表達對HIF-1α下游靶蛋白水平的影響

無義對照組細胞中HIF-1α下游靶蛋白的表達量與空白對照組間的差異無統(tǒng)計學顯著性；siRNA-HIF-1α組細胞中P21和Bax的蛋白水平較空白對照組顯著增加(P<0.05)，Bcl-2和VEGF蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖5、表2。

討 論

口腔癌的發(fā)病率位于惡性腫瘤的前列，近年來的新發(fā)病例逐漸增加，因此預防和治療口腔癌是一項艱巨的任務?？谇击[癌是口腔癌常見的病理類型，極易復發(fā)，嚴重影響人們的健康。HIF-1α是一種在多種實體腫瘤中高表達的基因，其表達量不僅與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關，還與腫瘤的轉移及患者的生存期密切相關，是預后不良和復發(fā)的常用指標[8-9]。HIF-1α已成為近年來研究的熱點致癌基因。本實驗通過RT-PCR和Western blot檢測口腔鱗癌Tca8113和CAL27細胞以及正常上皮細胞NOK中HIF-1α的表達量，結果顯示HIF-1α在口腔鱗癌Tca8113和CAL27細胞中的表達量顯著高于正常細胞NOK，表明HIF-1α在口腔鱗癌中的表達量顯著上調。研究表明，在口腔鱗癌組織中，HIF-1α的表達量上調[10]，表明HIF-1α可能參與口腔癌的發(fā)生、發(fā)展，其中HIF-1α在CAL27細胞中的表達量顯著高于Tca8113細胞，因此本文后續(xù)實驗以CAL27細胞為研究對象。

Figure 5.The images of Western blot for determining the protein levels of downstream molecules of HIF-1α after theHIF-1αexpression in the CAL27 cells was silenced.

圖5Westernblot檢測沉默HIF-1α表達對HIF-1α下游靶蛋白水平的影響

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細胞的惡性增殖和凋亡減少有關，其中細胞的過度增殖是惡性腫瘤的主要特征之一[11]。目前，在多種腫瘤細胞中特異性降低HIF-1α基因的表達，可顯著抑制細胞的增殖、凋亡等生物學特性[12-14]。在本研究中，采用脂質體將siRNA-HIF-1α表達載體轉染入CAL27細胞，結果發(fā)現siRNA-HIF-1α組細胞中HIF-1α的表達量顯著低于空白對照組，提示轉染成功；MTT和流式細胞術檢測細胞的活性和凋亡率，發(fā)現沉默HIF-1α的表達量顯著抑制CAL27細胞的活性，其凋亡率顯著增加。在膀胱癌、非小細胞肺癌中，下調HIF-1α的表達可抑制細胞的生長并誘導其凋亡，與本實驗結果一致，提示HIF-1α可能是口腔癌分子靶向治療的潛在位點。

表2沉默HIF-1α表達對HIF-1α下游靶蛋白水平的影響

Table 2.The effect ofHIF-1αknockdown on the protein levels of downstream molecules of HIF-1α (Mean±SD.n=3)

GroupP21Bcl-2BaxVEGFBlank control0.668±0.0781.265±0.1370.856±0.0841.355±0.0174Non-sense control0.652±0.0771.318±0.1420.863±0.0891.368±0.141siRNA-HIF-1α0.978±0.120*0.952±0.096*1.145±0.136*0.723±0.071*

*P<0.05vsblank control group.

眾所周知，Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Bcl-2家族蛋白根據其功能的不同分為抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，Bcl-2為主要的抑凋亡蛋白，Bax為主要的促凋亡蛋白。Bcl-2和Bax的表達量發(fā)生變化，誘導線粒體細胞色素C和凋亡誘導相關因子的分泌增加，激活細胞中caspase蛋白酶的活性，從而誘導細胞凋亡[15-16]。P21是一種重要的細胞周期依賴性激酶的抑制因子，主要通過抑制細胞周期G1/S的轉換，使細胞周期阻滯在G1期，從而抑制細胞的增殖[17-18]。HIF-1α在口腔癌中的作用機制尚不清楚。本研究中，siRNA-HIF-1α組細胞中Bcl-2的表達量顯著降低，Bax和P21蛋白水平顯著增加，提示HIF-1α可能通過調控Bcl-2家族蛋白的表達以及上調P21來發(fā)揮促CAL27細胞凋亡的作用。

腫瘤的預后主要表現在血管和淋巴的轉移，因此抑制腫瘤新血管的生成和淋巴轉移是提高腫瘤患者生存率、改善預后不良的重要策略[19-20]。腫瘤的血管生成與機體中的生長因子如VEGF等有關。研究表明，VEGF在多種實體腫瘤中表達量上調，與細胞的生物學行為密切相關，在腫瘤的新血管生成過程中發(fā)揮關鍵作用[21-23]。HIF-1α在調控VEGF表達的信號通路中發(fā)揮紐帶作用，不僅能顯著促進VEGF mRNA的表達量，還可顯著促進VEGF mRNA的穩(wěn)定性。CEACAM1是免疫球蛋白超家族的黏附分子，近年來發(fā)現其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[24]。CEACAM1主要參與調控與腫瘤預后相關的血管和淋巴管的生成。沉默CEACAM1基因的表達可抑制腫瘤毛細血管形成過程中VEGF誘導的血管形態(tài)發(fā)生效應[25]。本實驗結果發(fā)現，在口腔癌細胞中CEACAM1的表達量顯著高于正常上皮細胞，且與HIF-1α的表達量呈正相關性；沉默HIF-1α的表達顯著抑制VEGF蛋白水平，表明HIF-1α的表達量與CEACAM1和VEGF水平密切相關，HIF-1α可能通過影響CEACAM1和VEGF的水平，阻礙腫瘤組織新血管的生成，從而抑制口腔癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，HIF-1α在口腔癌細胞中高表達。沉默HIF-1α的表達可以抑制口腔癌CAL27細胞的活力，誘導其凋亡。這可能通過其下游基因的表達以及腫瘤血管的生成來發(fā)揮調控作用。HIF-1α有望成為抗口腔癌的潛在靶向位點。