李詩雅，韓青，蘇亞文，祁艷霞，趙前程，李智博

(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023)

菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum隸屬于軟體動物門、雙殼綱、簾蛤目、簾蛤科,南方俗稱花蛤，遼寧俗稱蜆子[1]，在中國遼寧、河北、福建、廣東等沿海地區(qū)均有分布。

貝類在加工成干制品或冷凍品時會產(chǎn)生蒸煮液。由于蒸煮液中含有較多的可溶性蛋白質(zhì)、糖類等功能性成分和營養(yǎng)物質(zhì)，未經(jīng)利用直接排放，既污染環(huán)境又浪費資源[2]。蛤類多糖具有很好的生物活性，抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、降低血脂和血糖、免疫調(diào)節(jié)和保護肝臟等活性都已被發(fā)現(xiàn)和證實[3]。當(dāng)前針對水產(chǎn)品加工產(chǎn)生廢棄液的研究主要集中在調(diào)味品開發(fā)[4]工作上，較少研究其功能性成分。對貝類蒸煮液中的多糖進行分離純化，研究其功能活性，不僅有利于副產(chǎn)物的綜合利用，而且能夠提升貝類附加值，為進一步研究相關(guān)功能性食品和藥物提供技術(shù)支持[5]。楊榮華等[6]從貽貝蒸煮液中提取的MJPs-1和MJPs-2多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用和抑制Raji細胞增殖的活性，且貽貝蒸煮液多糖的低毒性使其在保健品的開發(fā)，以及結(jié)合其他強抗癌制劑以降低藥物的細胞毒性方面具有極大的應(yīng)用價值。李蘋蘋等[7]以紫貽貝廢棄液為材料，對其濃縮液(DBM)進行營養(yǎng)功能成分測定，發(fā)現(xiàn)DBM營養(yǎng)及功能性成分豐富，其中總糖和蛋白質(zhì)的平均含量分別為12.06%和5.36%，富含?；撬岷偷V物質(zhì)，適于研制開發(fā)貽貝加工的系列產(chǎn)品。上述研究中關(guān)于營養(yǎng)成分的分析，為合理開發(fā)貝類蒸煮廢棄液提供了參考依據(jù)。

用乙醇分級沉淀法進行分離純化的依據(jù)是分子質(zhì)量的大小，故多糖的得率和組成隨著乙醇在醇沉?xí)r含量的不同而變化[8-9]，多糖的分子質(zhì)量與其生理活性密切相關(guān)[10]。史萬忠等[11]通過不同的醇沉濃度，分級沉淀獲得不同的沉淀物，通過比較不同醇沉濃度下河蚌多糖粗提物分級沉淀物的藥效，確定河蚌多糖粗提物的有效部位。王德青等[12]采取一步醇沉和分級醇沉法提取4種山藥多糖，探討了山藥多糖不同活性組分對淋巴細胞功能及體內(nèi)免疫活性的影響。本試驗中，以菲律賓蛤仔蒸煮液為原料，對其中的多糖組分采用分級醇沉法進行回收，計算得到粗多糖的回收率、提取率和純度，并通過剛果紅試驗、紅外光譜法、差示掃描量熱法和PMP柱前衍生高效液相色譜法[13-15]，對多糖組分進行結(jié)構(gòu)表征和單糖組成分析，最后測定各多糖組分對兩種自由基的清除作用，以期對菲律賓蛤仔蒸煮液多糖的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用菲律賓蛤仔蒸煮液購自遼寧安德食品有限公司。

主要試劑：葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖(Fuc)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖醛酸(GalUA)為美國Sigma公司產(chǎn)品；乙腈(色譜級) 為德國Meker公司產(chǎn)品；KBr粉末(光譜純)為美國PIKE公司產(chǎn)品；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、FeSO4·7H2O、MgCl2·6H2O、苯酚、三氟乙酸、30%過氧化氫、氯仿、水楊酸等，均為國產(chǎn)分析純。

儀器與設(shè)備：L-2000高效液相色譜儀(日本日立公司)；SYNERGY HI酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；Lambda 25紫外-可見分光光度計(美國PerkinElmer)；Cary 660 FTIR傅里葉變換紅外光譜儀(安捷倫科技有限公司)； Q20差示量熱掃描儀(美國TA公司)。

1.2 方法

1.2.1 分級醇沉 準(zhǔn)確量取菲律賓蛤仔蒸煮液500 mL，將其調(diào)整至固形物含量10%，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，使乙醇終濃度(體積分?jǐn)?shù)，下同)為20%，充分混勻，室溫下放置24 h后離心分離(9000 r/min，20 min，4 ℃)，收集沉淀物；將上清調(diào)節(jié)至乙醇終濃度為40%，24 h后離心分離沉淀物[15-18]；以此類推，再將上清乙醇終濃度調(diào)節(jié)到60%和80%，收集沉淀物，將得到的沉淀物凍干，依次得到4種分級醇沉多糖RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4。

1.2.2 總糖、還原糖含量的測定 用苯酚-硫酸法[19]測定總糖含量；用3,5-二硝基水楊酸比色法[20]測定還原糖含量。

1.2.3 多糖含量[21]、純度[22]、回收率[22]和提取率[21]的測定與計算

多糖含量=總糖含量-還原糖含量,

1.2.4 剛果紅試驗 取干燥的不同組分的多糖各2.0 mg溶解于1.0 mL去離子水中，加入100 μmol/L剛果紅試劑2.0 mL和不同濃度NaOH(0～0.4 mol/L)，以不添加多糖的剛果紅試劑為對照，用紫外光譜儀在190～700 nm波長下掃描，確定最大吸收波長[23]。

1.2.5 紅外光譜測定(IR) 取干燥的不同組分的多糖樣品各1 mg，與干燥KBr粉末按照質(zhì)量比1∶100混合并壓成透明薄片，用紅外光譜儀掃描并記錄吸收值(4000～400 cm-1)。

1.2.6 差示掃描量熱法(DSC) 取不同組分的多糖樣品各10 mg放入坩堝內(nèi)，將樣品壓樣后放入檢測池，調(diào)節(jié)N2流速為40 mL/min，以10 ℃/min從50 ℃升溫至400 ℃，根據(jù)其增長曲線，確定樣品的吸熱、放熱溫度范圍及焓變值。

1.2.7 柱前衍生高效液相色譜法測定單糖組成 采用PMP 柱前衍生-HPLC 法測定，具體方法參考文獻[24]并稍做修改。

色譜柱為 ZORBAX Eclipse XDB-C18 分離柱(4.6 mm×250 mm，5 μm),Agilent 1260高效液相色譜儀，紫外檢測器波長為 254 nm，流速為 1.0 mL/min，柱溫為 25 ℃，流動相A組成為15%乙腈+0.05 mol/L磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖溶液(pH 6.9)，流動相B組成為40%乙腈+ 0.05 mol/L磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖溶液(pH 6.9)，時間梯度為 0→10 min→40 min，流動相B濃度梯度為 0→8%→37%；進樣體積為 10 μL。

1.2.8 抗氧化能力測定

(1)對羥自由基(·OH)清除能力測定。參照Beeley[25]的方法并略做改進：分別吸取濃度為2、4、6、8、10、12 mg/mL不同組分多糖溶液1 mL，依次加入3 mL 2 mmol/L FeSO4、3 mL 1 mmol/L H2O2搖勻后，再加入3 mL 6 mmol/L水楊酸，37 ℃下水浴60 min后取出，靜置60 min，于510 nm波長處測定吸光度A1；用3 mL蒸餾水代替1 mmol/L H2O2作為本底，測定吸光度A2；空白對照用1 mL 95%乙醇代替樣品液，并測定吸光度A0。測定時以95%乙醇作為參比，清除率計算公式：

·OH清除率=1-(A1-A2)/A0×100%。

其中：A0為空白對照吸光度值；A1為樣液吸光度值；A2為本底吸光度值。

對·OH的半數(shù)清除(抑制)濃度(median elimination concentration，EC50)定義為清除50%自由基所需要的樣品質(zhì)量濃度，通過清除羥自由基線性回歸方程進行計算[26]。

(2)對DPPH·自由基清除能力的測定。參照Singh等[27]的方法并略做改進：分別吸取濃度為2、4、6、8、10、12 mg/mL不同組分多糖溶液2 mL，加入2 mL DPPH·，25 ℃水浴中反應(yīng)30 min后，于517 nm波長處測定其吸光度值A(chǔ)i；取2 mL樣液，加2 mL 95%乙醇，25 ℃水浴中反應(yīng)30 min后測定吸光度Aj；取2 mL DPPH·溶液，加入2 mL蒸餾水，25 ℃水浴中反應(yīng)30 min后測定吸光度A0。

DPPH·清除率=A0-(Ai-Aj)/A0×100%。

其中：A0為空白對照吸光度值；Ai為樣液吸光度值；Aj為本底吸光度值。

對DPPH·的EC50計算方法與對·OH的EC50計算類似。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，用t檢驗法進行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 分級醇沉

用乙醇沉淀多糖時，沉淀出來的多糖種類隨著乙醇濃度的升高而增多[28]。從表1可見：乙醇濃度越高，對多糖的提取越有利，當(dāng)乙醇濃度由20%升到60%時，RPCL的回收率顯著提高(P<0.05)，多糖的純度也顯著提高(P<0.05)，且當(dāng)乙醇濃度在60%時，達到多糖回收率和純度的最大值，初步推測這部分多糖的組成比較復(fù)雜，可能具有較高的生物活性；當(dāng)乙醇濃度為80%時，RPCL4的純度和回收率均顯著降低(P<0.05)，此時分級醇沉得到的蒸煮液多糖顏色較深，為明顯的淺黃棕色，這可能是因部分色素與多糖一起被沉淀下來，所以導(dǎo)致純度不高。

2.2 剛果紅試驗

表1菲律賓蛤仔蒸煮液多糖分級醇沉結(jié)果

Tab.1PrecipitationofpolysacharidefromcookingliquorfromManilaclam(PRCL)bydifferentconcentrationsofethanol

%

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)

Note：The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences

從圖1可看出，RPCL1與剛果紅結(jié)合所形成的絡(luò)合物的最大吸收波長(λmax)隨著 NaOH 濃度的增大紅移明顯發(fā)生。RPCL1在 NaOH 的濃度為 0.05～0.1 mol/L 范圍內(nèi)與剛果紅溶液的最大吸收波長逐漸增大，出現(xiàn)了明顯的亞穩(wěn)區(qū)，說明 RPCL1 存在三螺旋結(jié)構(gòu)，而 RPCL2、RPCL3、RPCL4卻沒有明顯變化。

圖1 RPCL 4種多糖-剛果紅絡(luò)合物在不同堿性環(huán)境中的最大吸收波長Fig.1 Helix-coil transition analysis of RPCL according to the absorption maximum of the Congo red-polysaccharide complex at various concentrations of NaOH

2.3 IR圖譜分析

多糖組分RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4的紅外光譜如圖2所示。首先，由于O-H伸縮振動和N-H伸縮振動，4種組分的多糖在3700～3200 cm-1處都有大吸收峰出現(xiàn)，羥基-OH和氨基-NH分別是糖類和糖胺聚糖所特有的基團。其次，在3000～2800 cm-1處都出現(xiàn)了一個吸收峰，且集中在2900 cm-1處附近，這是巖藻糖甲基-CH2-的C-H伸縮振動峰，說明這些多糖組分里都含有巖藻糖[29]，并且發(fā)現(xiàn)RPCL3此處有強烈吸收，可知巖藻糖在該組分中的含量較多。最后，由于乙酰氨基-CONH2的C=O的伸縮振動，4種組分的多糖在1650 cm-1附近都有吸收峰的出現(xiàn)，為乙酰氨基的特征吸收峰[30]，由此可知氨基糖存在于組分之中，結(jié)合1545 cm-1和1375～1450 cm-1附近的羧基-COOH吸收峰，可知糖醛酸存在于各個組分中。4種組分多糖在1200～950 cm-1波長范圍的吸收峰差別較大，提示4種多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)存在一定差異。

圖2 菲律賓蛤仔蒸煮液多糖分級醇沉多糖各組分的紅外光譜圖Fig.2 Infrared (IR) spectra of RPCL by different concentrations of alcohol precipitation

2.4 DSC圖譜分析

RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4的DSC圖譜如圖3所示。當(dāng)加熱溫度從40 ℃升溫到400 ℃時，RPCL1、RPCL2、RPCL3都是首先出現(xiàn)一個吸熱峰隨后出現(xiàn)一個放熱峰。分析吸熱峰的出現(xiàn)可能是由于多糖的吸水、熔化或者分解[31]。RPCL1在185.28 ℃時開始出現(xiàn)吸熱峰，并于193.40 ℃時達到最高點，焓值為4.964 J/g，在199.89 ℃時放熱峰開始出現(xiàn)，于202.67℃時達到最高點，焓值為173.7 J/g；RPCL2在137.03 ℃時開始出現(xiàn)放熱峰，在159.74 ℃時為放熱最高點，焓值為80.05 J/g，吸熱峰在232.42 ℃左右出現(xiàn)，在252.66 ℃時為吸熱最高點，焓值為36.27 J/g；RPCL3在186.37 ℃時開始出現(xiàn)放熱峰，在191.78 ℃時為放熱最高點，焓值為65.64 J/g，隨后又分別出現(xiàn)了一個較弱的放熱峰和吸熱峰；RPCL4沒有明顯的吸熱放熱現(xiàn)象。

2.5 RPCL單糖組成分析

圖4為多糖組分RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4經(jīng)PMP衍生后的HPLC色譜圖。由圖4可知，巖藻糖(Fuc)和葡萄糖(Glc)存在于RPCL1中，在RPCL2和RPCL3中都檢測到葡萄糖(Glc)、萄糖醛酸(GlcUA)和半乳糖醛酸(GalUA)，RPCL4中含有半乳糖醛酸(GalUA)、巖藻糖(Fuc)、葡萄糖(Glc)成分。HPLC結(jié)果發(fā)現(xiàn)：4種RPCL中都檢測到了葡萄糖(Glc)和巖藻糖(Fuc)，與紅外光譜結(jié)果分析基本一致，即各個組分中都含有巖藻糖(Fuc)；RPCL2、RPCL3都檢測到了葡萄糖醛酸(GlcUA)，RPCL2、RPCL3、RPCL4中都檢測到了半乳糖醛酸(GalUA)，氨基葡萄糖(GlcN)和氨基半乳糖鹽酸鹽(GalN)在RPCL各組分中均未檢測到。

圖3 菲律賓蛤仔多糖組分RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4的DSC圖譜分析Fig.3 DSC analysis of RPCL1, RPCL2, RPCL3,and RPCL4

圖4 RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4的柱前衍生物液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatography of pre-column derivatives of RPCL1, RPCL2, RPCL3, and RPCL4

從表2可見：各組分中Glc含量RPCL1>RPCL2>RPCL4>RPCL3；GalUA含量RPCL2>RPCL3>RPCL4；GlcUA含量RPCL3>RPCL2；Man含量RPCL3>RPCL2；Fuc含量RPCL3>RPCL4>RPCL2>RPCL1。單糖含量通過將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算得出，RPCL1中，Glc含量>Fuc含量；RPCL2中，Glc含量>GlcUA含量>GalUA含量>Fuc含量>Man含量；RPCL3中，F(xiàn)uc含量>GlcUA含量>Glc含量>GalUA含量>Man含量；RPCL4中，F(xiàn)uc含量>Glc含量>GalUA含量。

表2 RPCL各組分單糖含量Tab. 2 The monosaccharide contents of RPCL μg/mL

注：—表示未檢出；

Note：—，undetected

2.6 RPCL清除自由基的能力

由圖5-A可知，隨著糖濃度的增加，RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4對羥自由基(·OH)的清除能力逐漸增強，呈濃度依賴性；當(dāng)糖濃度為12 mg/mL時，RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4的羥自由基(·OH)清除率分別為75.26%、79.31%、84.85%和87.24%；計算得到各組分多糖的EC50濃度依次為RPCL4(3.26 mg/mL)>RPCL3(4.41 mg/mL)>RPCL2(4.62 mg/mL)>RPCL1(5.34 mg/mL)。由圖5-B可知：隨著糖濃度的增加，RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4對DPPH·自由基清除能力均逐漸增強；當(dāng)糖濃度為12 mg/mL時，RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4的DPPH·清除率分別為78.33%、82.13%、85.53%和96.31%；計算得到各組分多糖的EC50依次為RPCL4(4.97 mg/mL)>RPCL3(5.71 mg/mL)>RPCL2(6.84 mg/mL)>RPCL1(8.22 mg/mL)。4種多糖對羥自由基的清除能力均低于對DPPH·的清除能力。

圖5 菲律賓蛤仔多糖組分對羥自由基和DPPH·自由基的清除作用Fig.5 Inhibition effect of RPCL fractions for hydroxyl radicals and DPPH·

3 討論

傳統(tǒng)醇沉方法所得多糖的成分比較復(fù)雜，而分級醇沉法能夠?qū)μ穷惏凑辗肿恿窟M行簡單的分離，對于從貝類加工副產(chǎn)物中回收高效活性多糖組分具有重要的意義。具有規(guī)則三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖與剛果紅溶液結(jié)合會產(chǎn)生絡(luò)合物，該絡(luò)合物在紫外光譜掃描下的最大吸收波長與空白的剛果紅溶液相比會發(fā)生紅移，且存在的三股螺旋結(jié)構(gòu)越多位移就越大[32]。在剛果紅試驗中，RPCL2、RPCL3、RPCL4中沒有出現(xiàn)最大吸收波長急劇下降的現(xiàn)象，可能是由于其中無三螺旋鏈的構(gòu)象或其三螺旋鏈的構(gòu)象特異，使得處于糖鏈之間的氫鍵相互作用較強而不易解旋，無法與剛果紅生成絡(luò)合物[23]，這與王俊[33]報道的香菇多糖精制樣品LST1的結(jié)果相似。RPCL多糖和其他動物、植物多糖一樣，是一種生物大分子，分子量可達幾萬或幾十萬，溶于水時分子鏈逐漸伸展開；處于固態(tài)時，多糖鏈可能為半晶體狀態(tài)或無定形狀態(tài)[34]。本試驗結(jié)果與淀粉的差示掃描量熱法測定結(jié)果相對比，淀粉中有直鏈晶體，這種晶體有較大的晶體顆粒，結(jié)合的結(jié)實緊密不易被破壞；支鏈晶體也存在于淀粉中，尺寸較小且不堅固，容易被破壞[35]。因此，作者推測多糖組分RPCL1、RPCL2、RPCL3中可能具有直鏈晶體，而多糖組分RPCL4中無明顯吸熱放熱現(xiàn)象，所以無法判斷。RPCL1的柱前衍生液相色譜與紅外光譜分析結(jié)果略有不同，即未檢測到糖醛酸，分析可能是因為這個組分中糖醛酸的含量不高，未檢測到。由于RPCL1和RPCL4兩個組分多糖純度不高，含有雜質(zhì)和色素，導(dǎo)致檢測到的單糖種類不多，樣品未經(jīng)過進一步的分離純化，也可能檢測不到一些含量低的單糖。

羥自由基被認(rèn)為是毒性最強的活性氧自由基, 其反應(yīng)性極強, 壽命極短, 對機體的破壞作用最大, 是造成生物有機體過氧化損傷的主要因素[36]。王蒞莎等[37]研究的鮑魚臟器多糖，在樣品濃度為 0～2.0 mg/mL時對羥自由基的清除能力隨樣品濃度的增加而增大，與本試驗中RPCL的結(jié)果一致，呈濃度依賴性。DPPH·常被用來評價抗氧化劑的自由基清除活性[38]，賈彥明等[39]研究的海帶多糖C1對DPPH·有良好的清除效果，也同RPCL的結(jié)果一致，隨著糖濃度的增加對DPPH·自由基清除能力都逐漸增強。

4 結(jié)論

本研究中，利用20%、40%、60%、80%濃度的乙醇對菲律賓蛤仔蒸煮液中的多糖進行回收，得到4種粗多糖組分RPCL1、RPCL2、RPCL3和RPCL4。進一步研究表明：RPCL3純度最高，可達73.46%，回收率達到48.31%，提取率為 4.23%，顯著高于其他3個組分；4種多糖組分中都檢測到了葡萄糖(Glc)和巖藻糖(Fuc)，與紅外光譜結(jié)果分析基本一致；RPCL1存在三螺旋結(jié)構(gòu)，而 RPCL2、RPCL3、RPCL4沒有三螺旋鏈的構(gòu)象或其三螺旋鏈的構(gòu)象特異；4種多糖組分對DPPH·自由基和羥自由基(·OH)均具有清除作用，且有劑量依賴性，其清除能力依次為RPCL4 >RPCL3 >RPCL2 >RPCL1。