李曉雨，田燚，王偉，李延濤，劉鋼，郭然，叢佳

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023；3.大連圣亞旅游控股股份有限公司，遼寧 大連 116023；4.大連海洋大學(xué) 水生生物學(xué)實驗室，遼寧 大連 116023)

白條雙鋸魚Amphiprionfrenatus隸屬于雀鯛科Pomacentridae、海葵魚屬Amphiprion，是最常見的小丑魚品種之一，因其體色艷麗、易于飼養(yǎng)而深受人們青睞。近年來，海水觀賞魚產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，其貿(mào)易額由1975年僅占世界觀賞魚貿(mào)易額的1%增長到2005年的10%[1]。中國的休閑漁業(yè)產(chǎn)值也由2011年的256億元人民幣增長到2017年的665億元人民幣[2]。因此，迫切需要對白條雙鋸魚進行更深入地研究。

鹽度是影響魚類生存和繁衍的重要環(huán)境因子，它與魚體的滲透壓調(diào)節(jié)、離子濃度變化等各種生理生化反應(yīng)都關(guān)系密切。白條雙鋸魚自然分布的珊瑚礁海域環(huán)境十分穩(wěn)定，以大洲島珊瑚礁海域為例，其周年鹽度基本穩(wěn)定在33，變化范圍在1之內(nèi)[3]。然而，水族箱由于水體小加之溫度較高，水分極易蒸發(fā)，鹽度較容易出現(xiàn)波動，對小丑魚生長發(fā)育會產(chǎn)生一定影響[4]。

由于海水資源的限制，北京海洋館等許多內(nèi)陸水族館均采用人工海水，飼養(yǎng)小丑魚也以人工海水為主。目前，市售的海鹽品質(zhì)參差不齊，優(yōu)質(zhì)海鹽價格較為昂貴，如果可以低鹽度飼養(yǎng)小丑魚，則能夠節(jié)省養(yǎng)殖成本，擴大養(yǎng)殖范圍。同時，觀賞魚病害也是困擾養(yǎng)殖戶的一大問題，由于部分海水病原微生物不喜低鹽，所以單從病原體數(shù)量控制方面來說，低鹽環(huán)境可以降低某些疾病的發(fā)生率。因此，低鹽度飼養(yǎng)小丑魚已成為許多水族商家和魚友們的選擇。對于水生生物來說，鹽度作為一個重要的環(huán)境因子，對生物機體的各項生理生化指標的影響常制約著生物的生長發(fā)育，其對離子轉(zhuǎn)運酶和抗氧化酶活性的影響多年來已成為學(xué)者研究的熱點問題之一。隋延鳴[5]研究表明，鹽度為8.7～43.7時，伴隨鹽度的升高，三疣梭子蟹Portunustrituberculatus體內(nèi)的NKA活性呈先降低后升高趨勢，鹽度18.7為其等滲點。錢佳慧等[6]研究指出，鹽度和溫度對華貴櫛孔扇貝Chlamysnobilis血淋巴中SOD和CAT活性所建立的回歸模型影響極顯著。對于大菱鲆Scophthalmusmaximus幼魚來說，溫度恒定狀態(tài)下，鹽度變化會使各組織中的抗氧化酶活性低于對照組[7]。克氏原螯蝦Procambarusclarkii在同一鹽度水平脅迫條件下，血清SOD活性會隨脅迫時間的延長呈先升高后下降趨勢[8]。目前，有關(guān)小丑魚的研究主要集中在生長發(fā)育[9]、生活習(xí)性[10-11]、人工繁殖和胚胎發(fā)育等方面[4,12-13]，低鹽脅迫對其產(chǎn)生的生理影響方面的研究尚不多見。本研究中，分析了鹽度變化對白條雙鋸魚血細胞數(shù)量、離子轉(zhuǎn)運酶活性和抗氧化酶活性的影響，以期為其低鹽飼養(yǎng)的可行性方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用1齡健康白條雙鋸魚購自遼寧省大連市水族花卉市場，原產(chǎn)于海南島珊瑚礁海域，濕體質(zhì)量為(5.42±1.29)g，暫養(yǎng)于遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室。

試驗儀器主要有Olympus顯微鏡(CX21，Olympus Corporation)，多通道酶標儀(SpectraMax i3x型，美谷分子儀器有限公司)，高速冷凍離心機(CR22G，株式會社日立制作所)。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 試驗在容積為160 L的水族箱中進行。將試驗魚首先放入正常鹽度為31的海水中暫養(yǎng)7 d，在其狀態(tài)穩(wěn)定、正常開口攝食且無任何病害發(fā)生后，開始進行后續(xù)試驗。試驗海水為經(jīng)過沙濾的天然海水，通過添加曝氣24 h以上的自來水調(diào)節(jié)至目標鹽度。鹽度脅迫期間水溫為(25.0±0.5)℃，pH為7.92～8.29，持續(xù)充氣，保持溶解氧含量為3.7 mg/L以上。每天投喂人工配合飼料1次至其不再攝食為止。整個試驗過程中，每天吸底1次，清除殘餌糞便。

1.2.2 試驗設(shè)計 以原產(chǎn)地天然海水鹽度31為對照組，鹽度25、20為試驗組，將暫養(yǎng)的白條雙鋸魚隨機分為3組，每組設(shè)置3個平行，每個平行組飼養(yǎng)10尾魚，鹽度由31每24 h降低2個鹽度直至試驗組預(yù)設(shè)值。在鹽度達到預(yù)設(shè)值之后3、12、48 h 時分別從每組隨機選取3尾魚，并在每次取樣時稱量魚體質(zhì)量。用無菌針管抽取其血液于1.5 mL離心管內(nèi)用于后續(xù)試驗。存活試驗持續(xù)至鹽度達到預(yù)設(shè)值后的第15天。

圖1 鹽度變化模式圖Fig.1 Diagram of the salinity change patterns

1.2.3 指標的測定與計算

(1) 血液細胞數(shù)量。采用血球計數(shù)板,使用光學(xué)顯微鏡(10×10)對血液細胞數(shù)量進行直接計數(shù)。每個樣本重復(fù)統(tǒng)計3次，取其平均值。計算公式為

體細胞數(shù)量=A/5×25×B×104。

其中：A為血球計數(shù)板中4個角加中間位置共5個方格中的細胞總數(shù)；B為稀釋倍數(shù)。

(2) 鰓組織Na+-K+-ATP酶(NKA)活力的測定。準確稱取樣品鰓絲(凍存于-80 ℃)的質(zhì)量，加入9倍體積生理鹽水，冰浴條件下機械勻漿后，以2500 r/min離心10 min，取上清液，用10%勻漿上清液定磷法測定Na+-K+-ATP酶活性。樣品中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍染色測試盒(W067，南京建成生物工程研究所)測定。以超微量Na+-K+-ATP酶測試盒(A070-2，南京建成生物工程研究所)檢測每小時每毫克鰓組織蛋白組織中ATP分解成ADP產(chǎn)生1 μmoL無機磷的量為一個酶活力單位(U)。

(3) 肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定。利用黃嘌呤氧化酶法，以總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(A001-1，南京建成生物工程研究所)檢測每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為1個酶活力單位(U)。

(4) 肝臟過氧化氫酶(CAT)活力測定。以CAT測試盒(A007-1，南京建成生物工程研究所)檢測每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為一個酶活力單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0和Excel 2013軟件進行處理，均用平均值±標準差表示(mean±S.D.)，經(jīng)驗證數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后，對于不同鹽度脅迫條件下各指標的差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行檢驗，并使用Duncan多重比較法檢驗組間差異，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

存活試驗結(jié)果表明，白條雙鋸魚可在鹽度20和25的水體中正常攝食和存活，15 d的試驗期間內(nèi)存活率達100%，無死亡現(xiàn)象。

2.1 低鹽脅迫下白條雙鋸魚血細胞數(shù)目的變化

從圖2可見:低鹽脅迫48時，白條雙鋸魚血細胞數(shù)隨鹽度的降低而減少；鹽度25時的血細胞數(shù)與對照組(鹽度31)無顯著性差異(P>0.05)，當(dāng)鹽度降至20以后48 h時其血細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，與對照組和25鹽度組有顯著性差異(P<0.05)。

注：標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)Note: The means with different letters are significant differences among different groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences圖2 各鹽度組48 h時白條雙鋸魚血細胞總數(shù)Fig.2 Total number of blood cells in tomato clownfish Amphiprion frenatus in each salinity group at 48 h

2.2 低鹽脅迫下白條雙鋸魚鰓絲Na+-K+-ATP酶活力的變化

從圖3可見:隨脅迫時間的延長，20、25鹽度組Na+-K+-ATP酶活力均呈先顯著升高后顯著下降的趨勢；鹽度脅迫3 h時，25鹽度組鰓絲Na+-K+-ATP酶活力顯著高于對照組和20鹽度組(P<0.05)，即20鹽度組與對照組無顯著性差異(P>0.05)；鹽度脅迫12 h時，25鹽度組酶活力顯著升高(P<0.05)，達到(37.77±1.23)U/mg prot，處于整個試驗階段的最高值，20鹽度組活力低于25鹽度組但仍顯著高于對照組(P<0.05)；鹽度脅迫48 h時，25鹽度組酶活力仍顯著高于對照組(P<0.05)，20鹽度組維持48 h時，Na+-K+-ATP酶活力為(7.94±0.43)U/mg prot，與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

注：標有不同小寫字母者表示同一時間下不同鹽度組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同Note: The means with different letters in the same time are significant differences in different salinity groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia圖3 低鹽脅迫對白條雙鋸魚鰓絲Na+-K+-ATP酶活力的影響Fig.3 Effect of low salinity stress on the activities of Na+-K+-ATPase in gill of tomato clownfish Amphiprion frenatus

2.3 低鹽脅迫下白條雙鋸魚肝臟SOD活力的變化

從圖4可見：整個試驗周期內(nèi)，25鹽度組肝臟SOD活力隨脅迫時間的延長而逐漸升高，20鹽度組SOD活力隨脅迫時間的延長先升高后略有下降，但各鹽度組SOD活力與對照組均無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 低鹽脅迫對白條雙鋸魚肝臟SOD活力的影響Fig.4 Effects of low salinity stress on SOD activity in liver of tomato clownfish Amphiprion frenatus

2.4 低鹽脅迫下白條雙鋸魚肝臟CAT活力的變化

從圖5可見：20鹽度組在鹽度脅迫初期(3 h)肝臟CAT活力顯著高于對照組和25鹽度組(P<0.05)；隨著脅迫時間延長至12 h時酶活力開始下降且顯著低于其他兩組(P<0.05)；繼續(xù)延長脅迫時間至48 h時，CAT活力持續(xù)降低并顯著低于對照組(P<0.05)，暫無回升趨勢;25鹽度組肝臟CAT活力隨脅迫時間延長有先上升后下降的趨勢，但均與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

圖5 低鹽脅迫對白條雙鋸魚肝臟CAT活力的影響Fig.5 Effects of low salinity stress on CAT activity in liver of tomato clownfish Amphiprion frenatus

3 討論

3.1 低鹽脅迫對白條雙鋸魚血細胞數(shù)的影響

環(huán)境脅迫將通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)使魚體的血液成分發(fā)生變化，各項血液指標可作為判定魚體營養(yǎng)狀況、病理變化，以及對該生存環(huán)境的生理性適應(yīng)等方面的重要依據(jù)[14]。研究表明，缺氧會刺激魚類脾臟釋放大量紅細胞和血紅蛋白以抵御低氧環(huán)境[15]。處于低滲環(huán)境下，將導(dǎo)致許氏平鮋的線粒體數(shù)量有所減少，胞質(zhì)內(nèi)微細小管系統(tǒng)變得松散，說明在低鹽脅迫下，魚體進行離子平衡代謝調(diào)節(jié)的微細小管系統(tǒng)的工作量降低，能量消耗也隨之減少[16]。

本試驗結(jié)果表明，鹽度20脅迫48 h時，會使白條雙鋸魚血細胞總數(shù)明顯減少，推測這可能與其在低滲環(huán)境中血細胞的凋亡有關(guān)。張玉玉等[17]研究表明，隨著低鹽脅迫時間的延長，長蛸Octopusvariabilis血細胞中的顆粒細胞所占比率呈先升高后下降趨勢，小顆粒細胞比率顯著降低。王林等[18]研究表明，低鹽脅迫會使三疣梭子蟹血細胞數(shù)量顯著降低，在脅迫12 h后血細胞數(shù)量降至最低，后逐漸趨于穩(wěn)定，該結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。血細胞數(shù)量及其組成成分與生物體的免疫密切相關(guān)，隨著低鹽度脅迫劇烈程度的增加，血細胞凋亡，同時也改變血液組分以提升機體免疫能力，這是水生生物對低鹽脅迫的應(yīng)激反應(yīng)和應(yīng)對策略。另外，此現(xiàn)象也可能與其滲透調(diào)節(jié)過程中有水分進入血液有關(guān)。

3.2 低鹽脅迫對白條雙鋸魚鰓絲Na+-K+-ATP酶活力的影響

國內(nèi)外許多研究表明，鹽度變化對魚類鰓絲Na+-K+-ATP酶的活性有影響[19-20]。Na+-K+-ATP酶分布于氯細胞基底膜的內(nèi)褶上，是一種利用分解ATP產(chǎn)生能量進行主動轉(zhuǎn)運，釋放Na+、吸收K+的離子泵[14]。魚類通過改變鰓部氯細胞的數(shù)量、類型及位于其上的Na+-K+-ATP酶活性和亞單位異構(gòu)型以適應(yīng)外界鹽度的變化[21]。本試驗中，25鹽度組白條雙鋸魚鰓絲的Na+-K+-ATP酶活力在整個試驗周期內(nèi)始終顯著高于對照組，這是一種對外界環(huán)境變化的應(yīng)激反應(yīng)。隨著鹽度繼續(xù)降低，20鹽度組該酶活力在整個試驗周期內(nèi)顯著低于25鹽度組且與對照組無顯著性差異，說明鹽度降低至20會對白條雙鋸魚的離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)造成傷害。余德光等[22]研究表明，低鹽脅迫會使斜帶石斑魚Epinepheluscoioides幼魚鰓絲Na+-K+-ATP酶活力呈先升高后降低的趨勢，與本次試驗結(jié)果相一致。曾霖等[23]研究表明，大菱鲆幼魚鰓組織中的Na+-K+-ATP酶活力會隨著鹽度的升高而升高，在鹽度由12上升至36的過程中該酶活力一直呈上升趨勢，與本次試驗結(jié)果有差異，說明不同試驗對象、不同試驗條件，魚體對鹽度的變化會產(chǎn)生不一樣的應(yīng)答機制。

3.3 低鹽脅迫對白條雙鋸魚肝臟SOD活力的影響

動物體的SOD和CAT主要存在于肝細胞和紅細胞中，肝臟的抗氧化酶活性可代表魚體的抗氧化能力[24]。細胞中的羥自由基等活性氧的存在會通過氧化應(yīng)激損傷細胞大分子，對機體產(chǎn)生極為不利的影響，例如脂質(zhì)的過氧化將干擾和破壞膜的生物功能，加速疾病及衰老現(xiàn)象的產(chǎn)生[25-26]。SOD可催化機體內(nèi)的超氧化物經(jīng)歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，是判斷魚體抗應(yīng)激能力的重要指標。研究表明，許氏平鮋體內(nèi)SOD活性會隨著水體鹽度的降低而逐漸升高[27]。鹽度脅迫會使花鱸Lateolabraxmaculatus體內(nèi)SOD活性水平顯著升高，隨著時間的推移，由于魚體對此鹽度的適應(yīng)性，SOD活性水平會逐漸降低至正常水平[28]。本試驗中，白條雙鋸魚肝臟SOD活力水平在選定時間點測得的值均無顯著性差異。推測可能是因為白條雙鋸魚對低鹽脅迫的適應(yīng)性較強，也可能是由其他酶來清除機體產(chǎn)生的活性氧，故并未發(fā)現(xiàn)肝臟SOD活力顯著上升。

3.4 低鹽脅迫對白條雙鋸魚肝臟CAT活力的影響

CAT可將超氧陰離子自由基歧化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2催化分解為O2和H2O，使細胞免受H2O2毒害。本試驗中，CAT活力在鹽度25脅迫3 h和12 h時略有升高，之后又有所恢復(fù)，且整個脅迫期間內(nèi)該酶活力變化并不顯著，試驗魚體對鹽度25的水環(huán)境有較好的適應(yīng)性。鹽度降到20之后3 h時機體開始出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，CAT活力顯著升高，12 h時開始下降并持續(xù)下降，至48 h并無回升趨勢，這表明白條雙鋸魚并未適應(yīng)鹽度20的水環(huán)境。崔前進等[29]研究表明，鈍吻黃蓋鰈Pleuronectesyokohama幼魚肝臟CAT活力，隨低鹽脅迫時間的延長呈先上升后下降的趨勢。董燕[30]研究表明，鹽度22脅迫96 h時會使施氏鱘AcipenserschrenckiBrandt幼魚肝臟CAT活性呈先升高后降低的趨勢，12 h時達到峰值，12 h之前該組與15鹽度組無顯著性差異，說明當(dāng)環(huán)境鹽度超過魚類最適鹽度時，機體會通過提高CAT活力來提升自身的抗氧化能力，每種魚使CAT活性升高的條件有所不同。胡靜等[31]研究指出，同為?？~屬的克氏雙鋸魚Amphiprionclarkii在低鹽脅迫過程中(鹽度分別由35降至30、25、20、15)，24 h內(nèi)肝臟CAT活性均呈上升趨勢，48 h后逐漸恢復(fù)至正常水平，其CAT活性變化明顯大于本試驗結(jié)果，分析原因可能是本試驗中降低鹽度的過程相對于胡靜等的報道試驗要緩慢一些，本試驗是每天降低鹽度2，2～3 d后降至預(yù)設(shè)鹽度，而上述報道中采用的降鹽方式是直接將魚放入預(yù)設(shè)鹽度的水體中。從CAT活性變化來看，顯然在緩慢降低鹽度這種更為溫和的降鹽過程中魚體的應(yīng)激反應(yīng)更小，較有利于試驗生物的健康。

綜上所述，隨著鹽度的降低，脅迫時間的延長，白條雙鋸魚會增強Na+-K+-ATP酶活力以應(yīng)對環(huán)境的改變，機體相應(yīng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)魚體適應(yīng)低鹽脅迫環(huán)境后，該酶活性會逐漸恢復(fù)正常水平；低鹽脅迫對該種魚體SOD活性無顯著性影響，而最低鹽度(鹽度20)對CAT活性有顯著影響。因此，可得出初步結(jié)論，白條雙鋸魚可以適應(yīng)鹽度25的水環(huán)境，但本次試驗并未做低鹽脅迫對其發(fā)育及繁殖的影響。如果在僅要求魚可以存活的前提下，可以嘗試低鹽飼養(yǎng)。而緩慢降低鹽度，以更溫和的方式使魚體適應(yīng)低鹽環(huán)境對其健康養(yǎng)殖更加有利。需要關(guān)注的是，低鹽脅迫會使白條雙鋸魚血細胞數(shù)減少，而血液中的白細胞直接參與免疫應(yīng)答相關(guān)過程，其數(shù)目減少是否會對魚體的免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)生較大危害有待今后進一步研究。