劉佳亮,王琳超，曹學彬，李靜，李君華，宋盛亮，王福辰，劉石林

(1.山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術研究中心，山東 煙臺 264003；2.中國科學院海洋研究所，山東 青島 266071)

刺參Apostichopusjaponicus含有豐富的對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)，可作為大眾的保健食品，是“海產(chǎn)八珍”之一，也是中國北方沿海地區(qū)養(yǎng)殖的重要海珍品[1]。近年來，隨著刺參養(yǎng)殖范圍的逐漸擴大，作為飼料主要成分的各種大型藻類價格居高不下，養(yǎng)殖成本逐年增加，因此，增強刺參的攝食和消化能力、提高飼料利用率不僅可以減少養(yǎng)殖成本，還可以避免刺參養(yǎng)殖水域環(huán)境污染。另外，養(yǎng)殖過程中水溫、鹽度和人工操作等外界環(huán)境因子的變化均會造成刺參的應激反應，導致刺參攝食銳減、疾病發(fā)生。因此，尋找環(huán)保高效、無副作用的飼料添加劑成為解決上述問題的有效路徑。

鹽酸甜菜堿(Betaine hydrochloride，BHE)，又稱為甜菜堿鹽酸鹽，為晶體性粉末，呈白色至微黃色。甜菜堿鹽酸鹽是一種絕佳的富含營養(yǎng)的添加劑，普遍用于豬和雞等陸生經(jīng)濟動物養(yǎng)殖中，也用于魚類等水生動物養(yǎng)殖中，其功能與甜菜堿有相似之處[2]。已有研究表明，甜菜堿可促進動物生長，提供豐富的甲基作用于養(yǎng)殖動物體內(nèi)氨基酸和脂肪酸代謝；可提高飼料引誘效果，增加水產(chǎn)動物攝食量，從而顯著提升飼料利用率[3]。甜菜堿在預防水產(chǎn)魚類動物不良應激反應及提高其對不利環(huán)境因子的耐受力中均有較好表現(xiàn)[4]，但是甜菜堿對刺參攝食和免疫機能的影響目前尚未見報道。本試驗中，以鹽酸甜菜堿為添加劑，設置不同含量梯度的刺參飼料，研究BHE對刺參攝食能力、防御疾病能力和增重效果的影響，旨在摸清鹽酸甜菜堿有效的添加范圍，為鹽酸甜菜堿在棘皮動物配合飼料中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用刺參選用山東東方海洋科技股份有限公司育苗車間2017年上半年培育的刺參幼苗。挑選體質(zhì)量為(2.32±0.04)g同一批次健康幼參分別暫養(yǎng)于水泥池(4 m×3 m×1.6 m)中。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料的制備 基礎飼料為本公司健康養(yǎng)殖實驗中心生產(chǎn)的幼參配合飼料，投喂時1份基礎料混合4份風干海泥，基礎飼料的配方及營養(yǎng)水平見表1，包括藻類、微生物發(fā)酵過的豆粕、干麥麩等，粗脂肪在飼料中的比例是4.59%，粗蛋白質(zhì)為19.83%。飼料級的鹽酸甜菜堿購于上海市仟爵生物科技有限公司，純度為98.0%。在基礎飼料中分別添加0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的BHE制成4種試驗飼料，以不含有BHE的基礎飼料為對照飼料，將刺參飼料的不同成分用攪拌機充分混勻，保存在-20 ℃的低溫環(huán)境中待用。

表1基礎飼料配方及營養(yǎng)組成(風干基礎)

Tab.1Ingredientsandapproximatecompositionsofthebasaldiet(air-drybasis)

項目item組成 composition含量/%concentration原料 ingredient馬尾藻粉Sargasscem pallidium meal鼠尾藻粉Sargassum thunbergii meal脫膠海帶粉 degummed kelp meal貝殼粉 oyster shell whiting發(fā)酵豆粕 fermented soybean meal次粉 wheat middlings蝦粉 shrimp meal酵母粉 yeast meal維生素預混料 vitamin premix礦物質(zhì)預混料 mineral premix合計 total20.0020.0010.0020.008.008.007.005.001.001.00100.00營養(yǎng)水平nutrient level粗蛋白質(zhì) crude protein粗脂肪 crude lipid粗灰分 crude ash19.834.5948.30

1.2.2 試驗設計 養(yǎng)殖試驗容器為60 L白色塑鋼水桶，每個水桶放養(yǎng)30頭刺參，試驗設5組，每組設3個重復，分別投喂添加BHE為0(對照)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的飼料。試驗期間，連續(xù)充氣，溶氧>5 mg/L，海水鹽度為33～35，水溫為10.2～25.8 ℃。試驗用刺參最初需要投喂基礎飼料一周，使刺參適應養(yǎng)殖環(huán)境，在開始投喂含不同添加量的BHE飼料之前，要停喂2 d。試驗于2017年8—11月在山東東方海洋科技股份有限公司刺參研究中心試驗車間進行，養(yǎng)殖周期為90 d。試驗期間，每天換水二分之一，使用自制虹吸裝置清除水桶底部刺參糞便。每天用海泥混合料近飽食投喂不同組的刺參，同時依據(jù)刺參食欲增減投喂量。

1.2.3 樣品的采集 試驗開始時稱重一次，然后在試驗進行的第30、60、90 天時計數(shù)、稱量每桶刺參的體質(zhì)量，并從每個水桶中隨機抽取5頭刺參，獲取組織樣品。為了獲取干凈且無雜質(zhì)的腸道，解剖刺參腸道前停食48 h。稱量每個個體的體質(zhì)量，稱重前用吸水紙吸干刺參體表水分，稱重后在盛冰的瓷盤上解剖取其腸道，除去刺參體內(nèi)的呼吸樹及其他不相干部分，在4 ℃下用經(jīng)過雙蒸水配制的 pH 7.0的磷酸緩沖液(Na2HPO4-NaH2PO4)沖洗后，再用吸水紙除去液體，置于凍存管內(nèi)，-20 ℃下保存，用于消化酶和免疫指標的測定[5]。

1.2.4 指標的測定 刺參生長指標的計算公式分別為

存活率=100%×Nt/N0,

特定生長率SGR=100%×(lnWt-lnW0)/t,

出皮率=100%×Z1/Z2,

刺參干物質(zhì)表觀消化率[6]ADDM=100% ×

(1-S/F)。

其中：N0、Nt分別為試驗開始和試驗結束時刺參參數(shù)量(ind.)；W0、Wt分別為試驗開始時和試驗結束時刺參質(zhì)量(g)；t為試驗時間(d)；Z1為刺參體壁濕質(zhì)量(g)；Z2為刺參濕體質(zhì)量(g)；S為飼料中的酸不溶性灰分含量(%)；F為糞便中酸不溶性灰分含量(%)。

分別采用福林-酚試劑法和淀粉-碘顯色法測定刺參腸道蛋白酶和淀粉酶活力[7]。按照南京建成生物技術公司試劑盒說明書步驟測定刺參腸道組織中的SOD和AKP活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用 Excel軟件進行分析處理，采用SPSS 18.0軟件進行方差分析和Duncan多重比較，試驗結果用平均數(shù)±標準誤表示，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 投喂含有鹽酸甜菜堿的飼料對刺參幼參生長指標和干物質(zhì)表觀消化率的作用效果

從表2可見：試驗中各處理組刺參成活率無顯著性差異(P>0.05)；投喂含不同比例BHE的飼料能不同程度地提高刺參幼參的生長，當BHE含量為0.4%時，幼參的特定生長率達到最高值(P<0.05)，為1.80%/d，當飼料中 BHE含量繼續(xù)增加至0.6%時，幼參的特定生長率仍顯著高于對照組(P<0.05)，但當BHE添加量為0.8%時，幼參的特定生長率與對照組無顯著性差異(P>0.05)；飼料中添加BHE明顯影響幼參的出皮率，BHE添加組的出皮率均高于對照組，但僅0.4%和0.6% BHE添加組刺參的出皮率顯著高于對照組(P<0.05)，且BHE添加量為0.4%時幼參的出皮率最高，為63.23%；BHE添加組幼參的干物質(zhì)表觀消化率均顯著高于對照組(P<0.05)，且BHE含量為0.4%時，幼參的干物質(zhì)表觀消化率達到最高，為10.06%。

表2 飼料中加入BHE對刺參幼參生長性能和干物質(zhì)表觀消化率的作用Tab.2 Effects of dietary BHE on growth performance and ADDM of sea cucumber Apostichopus japonicus

注：同列中標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note： The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters within the same column are not significant differences,et sequentia

2.2 幼參腸道消化酶活力隨飼料中鹽酸甜菜堿添加量的變化

從表3可見：隨著試驗刺參個體的不斷生長，各組幼參腸道蛋白酶活力均有增加，淀粉酶活力則均有所減?。辉囼炦M行到30 d時，BHE添加組幼參腸道淀粉酶活力和蛋白酶活力均較對照組有顯著增加(P<0.05)，且0.4%添加組的淀粉酶活力(90.99 U/mg prot)大于其他各組，該組的腸道蛋白酶活力也達到最大值(35.87 U/mg prot)；試驗進行到60 d時，0.2%、0.4%、0.6% BHE添加組幼參腸道蛋白酶活力顯著高于對照組(P<0.05)，且0.4% BHE添加組幼參蛋白酶活力最高(41.63 U/mg prot)，各BHE添加組刺參淀粉酶活力均顯著低于對照組(P<0.05)，而各 BHE添加組(0.2%、0.4%、0.6%)間無顯著性差異(P>0.05)；試驗進行到90 d時，BHE添加組幼參腸道蛋白酶活力比對照組要高許多，其中，0.2%、0.4%、0.6% BHE添加組蛋白酶活力顯著高于對照組(P<0.05)，且0.4% BHE添加組蛋白酶活力最高，較對照組高出37.74%，各添加組淀粉酶活力均顯著低于對照組(P<0.05)，且BHE添加量最高(0.8%)時的淀粉酶活力最低(P<0.05)。

表3 飼料中加入BHE對刺參幼參腸道蛋白酶和淀粉酶活力的影響Tab.3 Effects of dietary BHE on intestinal protease and amylase activities of sea cucumber Apostichopus japonicus

2.3 幼參免疫性能隨飼料中鹽酸甜菜堿添加量的變化

從表4可見：與對照組相比，BHE添加組刺參的SOD、AKP活力均有不同程度增加，隨著試驗的進行各組刺參腸道中SOD活力呈先增加后減小的趨勢，而AKP活力則呈先降低后增加的趨勢。試驗進行到30 d 時，0.4% BHE添加組刺參幼參腸道 SOD活力增長最快，且顯著高于對照組(P<0.05)，而對照組AKP活力顯著低于各BHE添加組(P<0.05)。試驗進行到60 d時，僅0.4% BHE添加組刺參腸道SOD活力顯著高于對照組(P<0.05)，其他BHE添加組SOD活力與對照組無顯著性差異(P>0.05)；飼料中添加BHE，可提高刺參腸道AKP活力，但僅0.4% BHE添加組腸道AKP活力與對照組有顯著性差異(P<0.05)。在試驗90 d時，0.4%～0.8% BHE添加組腸道SOD活力均顯著高于不含鹽酸甜菜堿的對照組(P<0.05),SOD活力隨BHE添加量增加而升高，BHE添加量為0.8%時SOD活力最高(99.25 U/mg prot)；0.2%、0.4%和0.6% BHE添加組幼參腸道AKP活力與對照組有顯著性差異(P<0.05),0.4%添加組AKP活力最高(234.73 U/g prot)。

表4 飼料中加入BHE對刺參幼參腸道免疫指標的影響Tab.4 Effects of dietary betaine hydrochloride on intestinal immunity of sea cucumber Apostichopus japonicus

3 討論

3.1 鹽酸甜菜堿對刺參幼參生長指標的影響

甜菜堿可以刺激水產(chǎn)動物的嗅覺，并引誘動物攝食，一般在飼料中的添加量為0.5%～1.5%；甜菜堿也可以改善飼料適口性，縮短采食時間，避免殘餌長時間沉積腐敗污染水質(zhì)。動物體內(nèi)只有活化的甲硫氨酸才可以參與體內(nèi)的甲基代謝，而動物本身不能合成甲硫氨酸，必須從外部環(huán)境中攝取，甜菜堿可通過相關酶的催化作用，為高半胱氨酸提供甲基后轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸[8]。本研究結果表明，含有鹽酸甜菜堿的飼料能顯著促進刺參幼參的生長。目前，有關誘食劑能促進養(yǎng)殖動物的生長已有一些報道。劉勝高[9]用含有0.6%復合甜菜堿的飼料投喂翹嘴鲌CulteralburnusBasilewsky幼魚，其日均增重率、特定生長率均有改善，兩者隨復合甜菜堿添加量的增加而增大，呈先升高再降低的變化規(guī)律。楊代勤[10]用含有不同比例甜菜堿的飼料投喂黃鱔Monopterusalbus，結果顯示，甜菜堿添加組較未添加組黃鱔增重加快，飼料利用率提高，添加量為1.5%～2.0%時，黃鱔生長率最高。張文超等[11]報道，投喂含甜菜堿的飼料能夠改善軍曹魚Rachycentroncanadum的生長性能，添加水平為0.05%時生長性能最佳。李紅霞等[12]研究表明，用含有0.1%甜菜堿的飼料投喂異育銀鯽Carassaisauratusgibelio，魚的增重率顯著高于不含甜菜堿組，較對照組提高了10.28%；含有0.1%甜菜堿的試驗組異育銀鯽的干物質(zhì)表觀消化率比對照組顯著增加了9.36%。本試驗中，用含有0.2%～0.6% 鹽酸甜菜堿的飼料進行投喂，能顯著加快刺參幼參的生長，最優(yōu)添加水平為0.4%，與其他學者闡述的最優(yōu)添加劑量不一致，推測可能是由于刺參嗅覺功能不強，攝食行為較遲緩，造成對鹽酸甜菜堿的利用率與其他動物有差異。

飼料營養(yǎng)的干物質(zhì)表觀消化率可以用來衡量不同飼料能否被水產(chǎn)動物有效利用，用于指導飼料配方設計。鄒青[13]研究表明，進食含甜菜堿6 g/kg飼料的吉富羅非魚Oreochromisniloticus，能量、飼料干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)的表觀消化率明顯高于不含甜菜堿組。Seo等[14]研究表明，使用主要成分為藻粉和豆粕的食物飼喂刺參，表觀消化率超過36.0%。夏蘇東[15]報道，以70%的海泥和30%的6種藻粉飼喂刺參，不同藻粉組刺參的表觀消化率為9.63%～15.84%。本試驗中不同鹽酸甜菜堿添加組刺參幼參的干物質(zhì)表觀消化率變化范圍為4.87%～10.06%，鹽酸甜菜堿因具有良好的誘食效果，可提升刺參消化能力，故可以顯著提高飼料利用率。本次試驗過程中，投喂所用料的組成中有五分之四是海泥，飼料營養(yǎng)的干物質(zhì)表觀消化率低于其他學者報道中表述的干物質(zhì)表觀消化率。飼料中海泥含量較多估計是造成表觀消化率低的原因之一。

刺參出皮率代表刺參養(yǎng)殖的實際產(chǎn)出量，高磊等[16]研究表明，不同養(yǎng)殖模式中刺參的出皮率為55.4%～62.7%。本試驗中，刺參出皮率的變化范圍為57.80%～63.23%，刺參出皮率最大時的鹽酸甜菜堿添加量為0.4%，推測鹽酸甜菜堿添加量為0.4%時，最有利于體壁物質(zhì)的積累。

3.2 鹽酸甜菜堿對刺參幼參腸道消化相關酶的影響

消化酶是機體多種酶中一部分能夠起到催化消化作用的酶的統(tǒng)稱，包括與蛋白質(zhì)消化有關的蛋白酶、與淀粉分解有關的淀粉酶、與脂肪代謝有關的脂肪酶等。一些物質(zhì)加入飼料中可以增加機體消化相關酶的活力，而消化酶活力的增加可以改善動物對營養(yǎng)成分的消化和利用。伍莉等[17]報道，飼料中添加0.5%甜菜堿的處理組較對照組斑點叉尾鮰Ictaluruspunctatus腸道的淀粉酶和蛋白酶活力顯著提高。閻希柱等[18]對尼羅羅非魚Tilapianilotica的研究顯示，當飼料中含有0.5%的甜菜堿時，魚體腸道中蛋白酶和淀粉酶的活力達到頂峰。胡武波等[19]報道，使用含有不同濃度的甜菜堿投喂黃鱔，3種酶活力隨甜菜堿比例的上升，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶均呈上升趨勢。本試驗結果顯示，鹽酸甜菜堿添加組的幼參腸道蛋白酶活力均有提高，在試驗階段隨鹽酸甜菜堿添加水平的增加，幼參腸道蛋白酶活力的變化規(guī)律為先升后降。甜菜堿是高效的甲基供體，并且作為誘食劑刺激提升腸道蛋白酶活力，具有類似于蛋氨酸的性質(zhì)，進而促進飼料蛋白質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)化。鹽酸甜菜堿投喂初期，幼參腸道淀粉酶活力明顯提高，但隨著試驗的進行，鹽酸甜菜堿添加組刺參的淀粉酶活力均顯著低于對照組，淀粉酶活力隨鹽酸甜菜堿添加水平的提高逐漸降低。在養(yǎng)殖試驗開始不久，幼參腸道蛋白酶活力有顯著變化，而腸道淀粉酶活力變化相對緩慢，結合出皮率的變化，推測鹽酸甜菜堿能有效提高刺參機體蛋白質(zhì)積累，而對碳水化合物的代謝有抑制作用，其相關機制未來需進一步探索。

3.3 鹽酸甜菜堿對刺參幼參免疫性能的影響

刺參免疫包含細胞免疫和體液免疫。刺參的體液免疫是免疫相關活力因子對外來物質(zhì)識別打擊，同時也制造一些增加本身免疫力及保全免疫穩(wěn)定的抗氧化酶類[20]。刺參體液免疫中，AKP、ACP、SOD是幾種關鍵酶類[21]。在外界環(huán)境異物進入刺參機體時，體腔細胞會制造不同水解酶類對外來成分啟動消化和處理，AKP是一種磷酸單酯水解酶，可以降解有毒有害物質(zhì)，對食物的利用有關。SOD可以清除機體內(nèi)過剩的氧自由基，是體內(nèi)重要的抗氧化酶，使刺參免受氧自由基的危害。馮家斌等[22]研究表明，一定范圍內(nèi)，隨甜菜堿在飼料中加入比例的上升，黃鱔體內(nèi)溶菌酶和SOD活力逐漸提高，含有適量甜菜堿的飼料能夠提升魚類非特異性免疫效能，但添加過量時，溶菌酶和SOD活力反而會迅速下降。蔣雪櫻等[23]報道，在日糧中添加500 g/t甜菜堿可改善肉雞抗氧化性能，這是由于甜菜堿可通過提供甲基促進了谷胱甘肽(GSH)的合成，而 GSH是動物體內(nèi)關鍵的抗氧化物質(zhì)。在本試驗中，添加不同濃度的鹽酸甜菜堿可顯著提高幼參腸道的SOD酶活力，證明鹽酸甜菜堿可提高棘皮動物的非特異性免疫力，其原因可能是鹽酸甜菜堿可通過提供甲基促進機體抗氧化物質(zhì)的合成來發(fā)揮作用。今后的試驗要深入研究和解釋鹽酸甜菜堿與幼參免疫效應的關系，對長久投喂含鹽酸甜菜堿的飼料是否能持續(xù)提高刺參免疫性能，進行更深入地試驗驗證。