丁鑒鋒，溫嬙，霍忠明，聶鴻濤，閆喜武

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 遼寧 大連 116023; 2. 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116023)

貝殼是由貝類外套膜的邊緣細(xì)胞所分泌的物質(zhì)形成，其生長和色素形成受神經(jīng)系統(tǒng)控制[1]。貝殼的多層結(jié)構(gòu)由碳酸鈣晶體及其中分布的蛋白成分和色素構(gòu)成，色素是由外套膜細(xì)胞分泌并嵌入到生長邊緣，隨著殼的生長持續(xù)分泌到殼內(nèi)[2]。貝類殼色形成的主要色素有黑色素、卟啉和類胡蘿卜素等，其合成可能直接由少數(shù)幾個(gè)基因控制[3]。對不同殼色貝類的比較研究發(fā)現(xiàn)，黑色素形成途徑的相關(guān)基因差異表達(dá)是貝類殼色多態(tài)性形成的一個(gè)重要原因[3-5]。

在黑色素形成過程中，酚氧化酶(phenoloxidase, PO)參與L-多巴或多巴胺向黑色素的轉(zhuǎn)化過程，是黑色素形成的一種關(guān)鍵酶[6]。同時(shí)，酚氧化酶在無脊椎動物的免疫、包裹、黑化和識別自身/非自身等過程中也發(fā)揮重要作用[7]。由于無脊椎動物體內(nèi)的黑變(melanism)過程與先天性免疫過程存在共同的黑色素生成(也稱為酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng))途徑，無脊椎動物的體色與酚氧化酶介導(dǎo)的免疫能力間必然存在密切關(guān)系[8-9]。對一些節(jié)肢動物的研究發(fā)現(xiàn)，具有較強(qiáng)黑化作用或表皮中含有較多黑色素的個(gè)體表現(xiàn)出更高的免疫能力[10-12]。這種免疫差異能夠被細(xì)菌提取物肽聚糖(peptidoglycans，PGN)、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，以及真菌中提取的β-1,3-葡聚糖等激活并表現(xiàn)出來[9]。貝類體內(nèi)的酚氧化酶存在于多個(gè)組織中，外套膜合成和分泌的酚氧化酶可以轉(zhuǎn)運(yùn)到殼的棱柱層，參與黑色素的生物合成及色素形成過程[13-15]。有研究表明，貝類血淋巴細(xì)胞中的酚氧化酶也可能參與貝類的殼黑色素形成過程[16-17]。對太平洋牡蠣Crassostreagigas、櫛孔扇貝Chlamysfarreri、菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum、簾蛤Venerupisvariegata和文蛤Meretrixmeretrix的研究，證實(shí)了酚氧化酶在貝類抗菌感染中的重要作用[18-22]；對蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis和蝸牛Cepaeahortensis、Thebapisana和Cornuaspersummaximum的研究也發(fā)現(xiàn)，不同殼色貝類體內(nèi)酚氧化酶活性表現(xiàn)出差異[23-24]。因此，貝類殼色形成與免疫過程可能以酚氧化酶為媒介存在某種關(guān)聯(lián)。

菲律賓蛤仔隸屬于雙殼綱、簾蛤科、綴錦亞科、蛤仔屬，是一種中國沿海廣泛養(yǎng)殖的灘涂貝類，其殼面顏色千差萬別，是雙殼貝類中殼色多態(tài)性最復(fù)雜的種類之一。研究發(fā)現(xiàn)，不同殼色蛤仔在耐受性、抗逆性和生長速率等方面表現(xiàn)出顯著差異，并且能穩(wěn)定遺傳給下一代，但具體的作用機(jī)制尚不明確[24-28]。對不同殼色貝類的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，其差異表達(dá)基因分布在色素合成、生長、免疫和生物礦化等相關(guān)信號通路，色素形成信號通路主要集中在黑色素合成途徑[4-5]。本研究中，以3種不同殼色且經(jīng)轉(zhuǎn)錄組研究證實(shí)其外套膜組織酚氧化酶家族基因表達(dá)存在差異的菲律賓蛤仔為研究對象，檢測在用細(xì)菌提取物肽聚糖和脂多糖刺激后其血淋巴和外套膜組織中酚氧化酶活性的變化情況，以期分析殼色與酚氧化酶活性的關(guān)聯(lián)，為蛤仔的殼色形成和與抗逆性相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用菲律賓蛤仔的斑馬蛤、白蛤和橙色家系為遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心繁育的蛤仔家系，殼長為(2.1±0.3) cm，殼型完整且活力強(qiáng)，在50 L水體的養(yǎng)殖槽中暫養(yǎng)一周，養(yǎng)殖水溫為(18.0±0.5)℃，鹽度為32。暫養(yǎng)期間每天換水1次，并投喂螺旋藻粉，持續(xù)充氧。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 從3種殼色菲律賓蛤仔中各隨機(jī)挑選72枚，每種殼色蛤仔分為3組，每組24枚。每種殼色的3組蛤仔按50 μL/枚的劑量分別注射免疫促進(jìn)劑 LPS (100 μg/mL)和PGN (20 μg/mL)，空白對照注射等量的PBS緩沖液，注射相同藥品的蛤仔放入同一養(yǎng)殖槽中暫養(yǎng)，在注射后的0、3、6、12、24、48 h時(shí)從每種殼色蛤仔各注射組中隨機(jī)選取4枚個(gè)體，采集樣品組織用于后續(xù)分析。

1.2.2 樣品采集 使用1 mL無菌注射器，從菲律賓蛤仔圍心腔中分別抽取血淋巴400 μL，于4 ℃下以 4000 r/min 離心10 min，收集血淋巴細(xì)胞，液氮中冷凍后置于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆?。分離采集血淋細(xì)胞后的蛤仔外套膜200 mg，用液氮速凍后研成粉末，置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品裂解 向血淋巴細(xì)胞和外套膜樣品中加入裂解液500 μL，用勻漿機(jī)勻漿后，于4 ℃下 以1000 r/min 離心45 min，收集上清液用于酶活性和總蛋白含量的測定。

蛋白裂解液配制方法如下： 150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、1% TritonX-100和0.5% Igepal，按照1片/25 mL緩沖液的量加入不含EDTA的蛋白酶抑制劑(phosphatase inhibitor cocktail III 貝博生物)[29]。

1.2.4 酚氧化酶活性測定 采用Le Bris等[20]的方法測定酚氧化酶活性，以L-DOPA 為反應(yīng)底物。具體操作如下：將50 μL裂解液(包括血淋巴細(xì)胞和外套膜組織裂解上清液)加入96孔酶標(biāo)板孔中，再分別加入50 μL Tris-HCl緩沖液(0.10 mol/L，pH 8.0)，25 ℃下孵育10 min；每孔分別加入100 μL 0.04 mol/L L-DOPA?；旌暇鶆蚝笾糜诿笜?biāo)儀中, 在25 ℃條件下反應(yīng)30 min，讀取 492 nm處的吸光度值。L-DOPA的自發(fā)氧化采用相同方法同時(shí)測定，反應(yīng)物用純水替代裂解液，計(jì)算時(shí)將自發(fā)氧化的結(jié)果從測定值中剔除。

酚氧化酶的活性以每分鐘吸光度值的增加量(ΔA/min)進(jìn)行計(jì)算，公式為

PO活性(U /mg prot)=(ΔA/min×稀釋倍數(shù))/總蛋白濃度。

1.2.5 蛋白含量的測定 使用Bradford法蛋白檢測試劑盒(南京建成生物有限公司) 測定總蛋白含量，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色, 在酶標(biāo)儀上讀取595 nm波長下蛋白樣品的光密度值。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5 mg/mL BSA)稀釋液作為蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn), 計(jì)算血清總蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用 SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，不同時(shí)間點(diǎn)比較以0 h測定值為對照，同一殼色不同組織之間的比較采用t檢驗(yàn)法，顯著性水平設(shè)為 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種殼色菲律賓蛤仔血淋巴細(xì)胞和外套膜中PO活性比較

從圖1可見，3種殼色蛤仔血淋巴細(xì)胞中PO活性均顯著高于外套膜中的酶活性(P<0.05)，3種殼色蛤仔血淋巴細(xì)胞中PO活性依次為白蛤>橙蛤>斑馬蛤，外套膜中PO活性相差不大。

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示同一殼色不同組織間有顯著性差異(P<0.05)Note:Different lowercase letters represent significant differences between tissues in the same shell-color group (P<0.05)圖1 3種殼色菲律賓蛤仔血淋巴細(xì)胞與外套膜組織中酚氧化活性的比較Fig.1 Comparison of the phenoloxidase activity in hemocytes and mantle of the three shell-color clams

2.2 3種殼色菲律賓蛤仔注射LPS后血淋巴細(xì)胞和外套膜組織中PO活性比較

注射LPS后，3種殼色菲律賓蛤仔血淋巴細(xì)胞和外套膜中PO活性變化如圖2所示。從圖2可見，注射LPS后，隨著時(shí)間的延長，3種殼色血淋巴細(xì)胞中的PO活性均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，橙蛤在被刺激后3 h、斑馬蛤和白蛤在刺激后12 h時(shí)，PO活性均達(dá)到最大值且顯著高于0 h(P<0.05)；48 h時(shí)，3種蛤仔PO活性恢復(fù)至接近0 h水平，且斑馬蛤血淋巴PO活性顯著高于橙蛤(P<0.05)。

從圖2還可見，注射LPS后，隨著時(shí)間的延長，3種殼色外套膜中的PO活性均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，橙蛤和斑馬蛤在被刺激后6 h時(shí)PO活性達(dá)到最大值且顯著高于0 h(P<0.05)，白蛤在被刺激后24 h時(shí)達(dá)到最大值且顯著高于0 h(P<0.05)；48 h時(shí)3種蛤仔PO活性均恢復(fù)至0 h水平。

2.3 3種殼色菲律賓蛤仔注射PGN后血淋巴細(xì)胞和外套膜組織PO活性比較

注射PGN后，3種殼色菲律賓蛤仔血淋巴細(xì)胞和外套膜中PO活性變化如圖3所示。從圖3可見，注射PGN后，隨著時(shí)間的延長，橙蛤的PO活性表現(xiàn)出降低的趨勢，在24 h時(shí)PO活性達(dá)到最低值，而斑馬蛤和白蛤血淋巴細(xì)胞中PO活性均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，斑馬蛤在被刺激后12 h、白蛤在刺激后6 h時(shí)，PO活性達(dá)均到最大值(P<0.05)；在注射后6 h時(shí)，白蛤血淋巴細(xì)胞中PO活性顯著高于橙蛤和斑馬蛤(P<0.05)，注射后12 h時(shí)，斑馬蛤血淋巴細(xì)胞中PO活性顯著高于橙蛤和白蛤(P<0.05)。

注：標(biāo)有不同大寫字母者表示不同時(shí)間點(diǎn)與0 h比較有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有不同小寫字母者表示同一時(shí)間點(diǎn)不同組織間比較有顯著性差異(P<0.05)，下同Note: Different capital letters indicate significant difference between 0 h and different time points(P<0.05); Different lowercase letters represent significant differences between tissues at the same time (P<0.05)，et sequentia圖2 LPS刺激后3種殼色菲律賓蛤仔血淋巴細(xì)胞和外套膜組織中PO活性的變化Fig.2 Changes in phenoloxidase activity in hemocytes and mantles of the three shell-color clams injected with LPS

從圖3還可見，注射PGN后，隨著時(shí)間的延長，3種殼色外套膜中的PO活性均表現(xiàn)出升高的趨勢，橙蛤在注射后12 h時(shí)達(dá)到最大值且顯著高于0 h(P<0.05)，而其他兩種殼色蛤仔外套膜中PO活性雖有升高但不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 菲律賓蛤仔外套膜和血淋巴細(xì)胞中PO的分布

圖3 PGN刺激后3種殼色菲律賓蛤仔血淋巴細(xì)胞和外套膜組織中PO活性的變化Fig.3 Changes in phenoloxidase activity in hemocytes and mantles of the three shell-color clams injected with PGN

酚氧化酶又名酪氨酸酶，是一種含銅的酶，在哺乳動物體內(nèi)通常稱為酪氨酸酶，無脊椎動物一般稱為PO，能夠催化單酚羥化成二酚(如多巴)，并把二酚氧化成醌。醌在非酶促條件下，形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物是黑色素[30]。PO在體內(nèi)的不同組織中能夠發(fā)揮不同的作用，如在血淋巴細(xì)胞中作為免疫效應(yīng)因子，在血淋巴中作為化學(xué)遞質(zhì)，在鰓、足和外套膜中參與黏附蛋白的組成及貝殼的形成和修復(fù)等過程[16]。本研究中，在菲律賓蛤仔的鰓和外套膜組織中均檢測到PO活性，且3種殼色蛤仔外套膜中的PO活性均顯著低于其血淋巴中的酶活性。究其原因主要可能與蛤仔外套膜細(xì)胞中較高的Ca2+水平有關(guān)。對節(jié)肢動物的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的Ca2+能夠抑制酚氧化酶原的激活導(dǎo)致PO活性較低[31-32]，在一些血淋巴中含有較高Ca2+含量的蝸牛Cepaeahortensis、Thebapisana和Cornuaspersummaximum體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[24]。因此，作為貝類參與殼礦化過程主要細(xì)胞分布的組織，蛤仔外套膜中高濃度的Ca2+是導(dǎo)致其PO活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于血淋巴的一個(gè)重要原因[33]。

3.2 菲律賓蛤仔外套膜和血淋巴細(xì)胞中PO的免疫應(yīng)答作用

研究表明, PO 是大多數(shù)貝類先天免疫防御系統(tǒng)中的重要酶之一[16]。雙殼貝類體內(nèi)的PO能夠被真菌β-1,3-葡聚糖及細(xì)菌的肽聚糖和脂多糖誘導(dǎo)，這一激活過程通常由病原模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)所觸發(fā)[34]。櫛孔扇貝C.farreri體內(nèi)的PO被證實(shí)具有抗菌活性[19, 35]。Richard等[36]和Le Bris等[37]用弧菌V.tapetis刺激菲律賓蛤仔后其血淋巴PO活性也顯著升高[36-37]。Aladaileh等[34]使用LPS刺激牡蠣Saccostreaglomerata后其血淋巴細(xì)胞中PO活性顯著升高。此外，使用脂多糖刺激櫛孔扇貝后其血淋巴中PO活性顯著升高[19]。本研究中，在受到肽聚糖和脂多糖刺激后，3種殼色蛤仔血淋巴細(xì)胞和外套膜中的PO活性均表現(xiàn)出升高的過程。表明蛤仔體內(nèi)的PO在受到病原微生物的感染時(shí)，能夠被激活并參與到對病原的免疫反應(yīng)過程[7]。此外，本研究中蛤仔外套膜中PO的升高程度要低于血淋巴中的PO，這可能與PO在不同組織中的作用差異有關(guān)[16]。

3.3 菲律賓蛤仔體內(nèi)PO在蛤仔殼黑色素形成和免疫防御中的作用

無脊椎動物體內(nèi)的PO參與體內(nèi)黑色素的形成過程，這一生化反應(yīng)過程在機(jī)體的免疫和黑變(melanism)過程中具有關(guān)鍵作用，因此，無脊椎動物體內(nèi)黑色素含量與免疫能力之間存在相關(guān)性[8-9]。對黃粉蟲甲蟲Tenebriomolitor的研究發(fā)現(xiàn)，黑色個(gè)體較黃褐色個(gè)體含有更多的黑色素，被脂多糖刺激后體內(nèi)PO活性也顯著高于黃褐色個(gè)體，能夠更有效地抵御病原感染[10]。角質(zhì)層黑色素含量較多的南方地蟋Allonemobiussocius也表現(xiàn)出更卓越的以黑色素為基礎(chǔ)的免疫能力[38]。對蝦夷扇貝的研究發(fā)現(xiàn)，黑色素含量較多的黑色個(gè)體PO活性顯著高于含黑色素較少的白色個(gè)體[23]。Scheil等[24]對3種蝸牛Cepaeahortensis、Thebapisana和Cornuaspersummaximum的比較研究發(fā)現(xiàn)，深色蝸牛的血淋巴中PO活性遠(yuǎn)高于淺色個(gè)體。黑色素含量的差異也是貝類殼色多樣性形成的重要原因之一[3]。Nagai等[13]在合浦珠母貝Pinctadafucata體內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩種與殼黑色素形成相關(guān)的基因——Pfty1和Pfty2，其編碼的蛋白具有PO的活性。對貽貝Meretrixmeretrix轉(zhuǎn)錄組的研究也發(fā)現(xiàn)，不同殼色貽貝的黑色素形成信號通路相關(guān)基因表達(dá)存在顯著差異[5]。以上結(jié)果表明：不同殼色貝類基于黑色素合成途徑的免疫能力也應(yīng)存在差異。本研究中，3種殼色蛤仔血淋巴中PO活性受病原刺激后均出現(xiàn)升高的過程，但升高的幅度存在差異，其中，斑馬蛤在被刺激12 h后血淋巴中PO活性顯著高于其他兩種殼色，白蛤被肽聚糖刺激6 h后血淋巴中PO活性顯著高于其他兩種殼色。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同殼色菲律賓蛤仔群體抗逆性存在著顯著的差異[27, 39]。因此，作為貝類殼中黑色素形成的關(guān)鍵酶——PO，在不同殼色蛤仔受病原刺激后其活性變化表現(xiàn)出的差異，可能是不同殼色蛤仔抗逆性不同的重要原因之一，該結(jié)果初步證實(shí)了蛤仔殼色形成與免疫過程間存在關(guān)聯(lián)，可為菲律賓蛤仔的殼色選育提供理論支持。