彭會，王克堅

(1.廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361102； 2.海洋生物制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，福建 廈門 361102)

多重耐藥性超級細菌頻繁出現(xiàn)，威脅著人類健康和公共衛(wèi)生安全，開發(fā)新型抗菌藥物刻不容緩?？咕氖且活悘纳矬w中分離的小分子多肽，廣泛存在于生物界的各個門類，其進化上相對保守，在抵抗病原微生物感染方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。隨著對抗菌肽的深入研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)抗菌肽具有多重生物學(xué)功能，不但具有抗細菌作用，還具有抗病毒、抗真菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和促進創(chuàng)傷修復(fù)等生物學(xué)功能[1-4]。研究、開發(fā)與應(yīng)用抗菌肽，對解決細菌耐藥性和飼料中濫用抗生素造成的藥物殘留及環(huán)境污染等問題具有重要的科學(xué)意義和實際應(yīng)用價值。

抗菌肽Scygonadin(簡記為Scy)是廈門大學(xué)海洋生物制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室2006年首次報道的從雄性擬穴青蟹Scyllaparamamosain精漿中分離鑒定的一個新型抗菌肽，在畢赤酵母Pichiapastoris表達系統(tǒng)中可以獲得高表達，其表達產(chǎn)物對溶壁微球菌Micrococcuslysodeikticus、谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila和熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens具有較強的抗菌活性(最小抑菌濃度MIC<25 μmol/L)，并對對蝦白斑病毒(WSSV)具有一定的抑殺作用[5]。Hepcidin 3 (簡記為Hep3)是2013年在斜帶石斑魚Epinephecuscoioides中新發(fā)現(xiàn)的Hepcidin抗菌肽，不同于常見的含有8個半胱氨酸殘基形成的四對二硫鍵的Hepcidin，其主要特點是含有4個半胱氨酸殘基形成的兩對二硫鍵，其原核表達產(chǎn)物能選擇性地抑制革蘭氏陽性和陰性菌，殺菌動力學(xué)曲線顯示，12 μmol/L的重組蛋白Hep3能夠在60 min內(nèi)殺滅全部金黃色葡萄球菌，30 min內(nèi)殺滅全部施氏假單胞菌Pseudomonasstutzeri，顯示出較大的應(yīng)用價值[6]。

本試驗中，通過重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建了抗菌肽Scy和Hep3的真核融合表達載體pPIC9K-scy-hep3，在畢赤酵母 GS115菌株中誘導(dǎo)表達獲得雜合抗菌肽Scy-Hep3，并闡明其抗菌活性和抗菌譜，旨在為雜合抗菌肽Scy-Hep3的生產(chǎn)和開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體與菌株 畢赤酵母表達用載體pPIC9K和菌株GS115均購自Invitrogen公司?？咕囼炗镁辏航瘘S色葡萄球菌、溶壁微球菌、谷氨酸棒桿菌、施氏假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus、弗氏志賀氏菌Shigellaflexneri、熒光假單胞菌和嗜水氣單胞菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒小量中量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自廣州東盛科技有限公司；DNA聚合酶購自全式金公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ和DNA 連接Kit購自TaKaRa公司；酵母粉和胰蛋白胨購自O(shè)XOID公司；丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺購自生工生物工程(上海)股份有限公司；HisTrapTMFF crude 5 mL購自GE公司；預(yù)染蛋白Marker購自Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因片段 根據(jù)分泌型表達載體pPIC9K上的EcoRI和NotⅠ酶切位點，以及擬穴青蟹抗菌肽scy基因的cDNA序列(GenBank登錄號：AY864802)和斜帶石斑魚hep3基因的 cDNA序列(GenBank登錄號：HQ008222)，運用重疊延伸PCR原理設(shè)計雜合肽scy-hep3的上、下游引物，兩個基因中間連接肽(Linker)的氨基酸序列為GGPGSG，其對應(yīng)的堿基序列為5′ GGTGGCCCAGGTTCCGGT 3′(見表1引物F2方框內(nèi)堿基序列)，該段堿基序列的反向互補序列為5′ ACCGGAACCTGGGCCACC 3′(見表1 引物R1方框內(nèi)堿基序列)。將連接肽的堿基序列設(shè)計成重疊互補序列，重疊區(qū)互為模板便于PCR擴增出全長目的基因片段。同時為檢測目的基因的表達，在引物R2中終止密碼子前引入組氨酸標(biāo)簽(6×His標(biāo)簽)，大小為18 bp。使用重疊延伸PCR方法，以上述擬穴青蟹抗菌肽scy的cDNA序列和hep3的cDNA序列為模板，分別以F1和R1、F2和R2為上、下游引物，PCR擴增獲得scy和hep3基因片段。然后以獲得的scy基因片段和hep3基因片段為模板，以F1和R2為上、下游引物，PCR擴增獲得scy-hep3目的基因片段。

表1scy-hep3目的基因擴增的上、下游引物

Tab.1PrimersusedforthepPIC9K-scy-hep3plasmidconstruction

引物primer序列sequence(5′ -3′)F1GGGGAATTCGGCCAGGCACTCAACAAR1ACCGGAACCTGGGCCACCGTAAGAAGCAA- TCCAGTCCT-CGACCTCF2GGTGGCCCAGGTTCCGGTTTACCCGTCACT- GGAGTAGA-AGAGCTGR2CATGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGATGATG- TTGGAAGTCACAGCGGACTCCGCAG

注：其中下劃線為限制性內(nèi)切酶位點，方框內(nèi)為重疊互補序列，斜體部分為6×His組氨酸標(biāo)簽

Note： The sequences of restriction enzyme sites are shown underlined and the overlap complementary sequences of F2 and R1 are shown the box.Italics indicate sequences coding the hexa-histidine tag

1.2.2 pPIC9K-scy-hep3表達載體的構(gòu)建 用DNA凝膠回收試劑盒回收scy-hep3目的基因片段，scy-hep3基因片段和載體pPIC9K用EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶于37 ℃下酶切5～6 h，回收酶切后的基因片段和載體，并用DNA 連接Kit在16 ℃下連接，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含100 μg/mL Amp抗生素的固體LB培養(yǎng)板上，37 ℃下培養(yǎng)過夜。任意挑取若干單克隆用F1和R2引物進行PCR擴增鑒定，并將陽性克隆送交英濰捷基貿(mào)易有限公司進行基因測序。

1.2.3 pPIC9K-scy-hep3載體的轉(zhuǎn)化 將測序正確的重組質(zhì)粒pPIC9K-scy-hep3用SalⅠ內(nèi)切酶進行線性化，用DNA凝膠回收線性化的質(zhì)粒，取10 μL回收產(chǎn)物與80 μL GS115感受態(tài)細胞混合均勻，用電轉(zhuǎn)化的方法將目的基因整合至酵母基因組中，將轉(zhuǎn)化液涂布于MD選擇培養(yǎng)平板上，28 ℃下培養(yǎng)2 d，將長出的陽性單克隆分別轉(zhuǎn)移至YPD平板上，以備后續(xù)高效表達菌株的篩選。

1.2.4 雜合抗菌肽Scy-Hep3的真核表達及高效表達菌株的篩選 挑取如上若干個單克隆，分別接種于10 mL BMGY(pH 6.0)培養(yǎng)基中，30 ℃下以230 r/min振蕩培養(yǎng)約20 h至對數(shù)生長期，以2000g離心收集菌體，并將其重懸于10 mL BMMY表達培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后離心收集上清液，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達情況[5]。

1.2.5 抗菌肽Scy-Hep3的大量表達與純化 將重組畢赤酵母表達菌株GS115/pPIC9K-scy-hep3表達24 h后，離心獲得發(fā)酵上清液，在磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L磷酸緩沖液+50 mmol/L NaCl，pH 8.5)中透析，以12000g離心，上清液用0.45 μm濾膜進行過濾，待上柱純化。用5個柱體積去離子水清洗HisTrap純化柱(HisTrapTMFF Crude 5 mL)，流速為2 mL/min；5個柱體積的平衡緩沖液(20 mmol/L磷酸緩沖液+50 mmol/L NaCl+10 mmol/L 咪唑，pH 8.5)平衡柱子，流速為2 mL/min；將過濾后的發(fā)酵上清液上樣，流速為2 mL/min；用3～5個柱體積的平衡緩沖液過柱洗去未結(jié)合的雜蛋白；用流速1 mL/min的洗脫緩沖液(20 mmol/L磷酸緩沖液+150 mmol/L NaCl+250 mmol/L 咪唑，pH 8.5)過柱，洗脫目的蛋白，收集洗脫液并進行SDS-PAGE檢測。

1.2.6 雜合抗菌肽Scy-Hep3的最小抑菌濃度的測定 最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration, MIC)的測定在96孔細胞培養(yǎng)板上進行[7-8]。將-80 ℃下保種的金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌、谷氨酸棒桿菌、施氏假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、弗氏志賀氏菌、熒光假單胞菌和嗜水氣單胞菌劃線于營養(yǎng)肉湯平板上，在28 ℃或37 ℃下倒置培養(yǎng)過夜；從各平板上挑取菌落接種于MH培養(yǎng)基斜面上，繼續(xù)培養(yǎng)12～18 h；用10 mmol/L磷酸鈉緩沖液(DPBS，pH 7.2)將細菌從斜面上沖下，用酶標(biāo)儀測定各個細菌在600 nm波長下的吸光值(OD600 nm)，調(diào)整菌懸液濃度至OD600 nm為 0.003備用。在96孔細胞培養(yǎng)板上，每種被測細菌都設(shè)置陽性對照組和待測蛋白試驗組，每組設(shè)置3個平行。其中陽性對照組為50 μL磷酸鈉鹽緩沖液和50 μL含MH培養(yǎng)液的菌懸液，待測蛋白試驗組為50 μL待測蛋白樣品和50 μL含MH培養(yǎng)液的菌懸液。將細胞培養(yǎng)板置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，觀察待測MIC結(jié)果。以上試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因片段scy-hep3的獲得

以筆者所在實驗室前期已獲得的擬穴青蟹抗菌肽scy的cDNA序列(GenBank登錄號：AY864802)和斜帶石斑魚hep3的 cDNA序列(GenBank登錄號：HQ008222)為模板，分別以F1和R1、F2和R2為上、下游引物(表1)，用20 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳分析，PCR擴增獲得scy成熟肽基因相關(guān)片段約330 bp(圖1-A，第2泳道)和hep3基因相關(guān)片段約240 bp(圖1-A，第3泳道)。最后以上述PCR擴增獲得的scy成熟肽基因片段和hep3基因片段為模版，以F1和R2為上、下游引物，擴增獲得560 bp的雜合肽scy-hep3目的基因片段(圖1-A，第1泳道)，與預(yù)期目的條帶大小相符。

2.2 真核重組表達載體的構(gòu)建與鑒定

經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后的表達載體pPIC9K為單一的約9400 bp大小的清晰條帶，與載體實際大小相符(圖1-B)。經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切的雜合抗菌肽scy-hep3目的基因片段和pPIC9K連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α后，取若干陽性克隆搖菌培養(yǎng)，并進行PCR鑒定，得到的陽性克隆片段長度560 bp(圖1-C)，與預(yù)期大小相符。選擇陽性克隆送至英濰捷基貿(mào)易有限公司測序，測序結(jié)果表明，目的基因scy-hep3已成功構(gòu)建至表達載體pPIC9K上。

如圖2-A所示，分泌型重組表達載體pPIC9K-scy-hep3的特點是其N端采用AOX1啟動子，用信號肽α-factor引導(dǎo)目的蛋白Scy-Hep3分泌到胞外表達，在抗菌肽scy基因和hep3基因間加入連接肽序列，并在C端帶有6×His標(biāo)簽，便于親和層析純化目的蛋白。推導(dǎo)的氨基酸序列組成見圖2-B。

2.3 雜合抗菌肽Scy-Hep3在畢赤酵母中的表達及高效表達菌株的篩選

將測序正確的重組表達載體pPIC9K-scy-hep3用SalⅠ限制性內(nèi)切酶線性化，將其電轉(zhuǎn)入酵母菌GS115后，在選擇性平板MD上培養(yǎng)。之后隨機挑取若干個重組酵母轉(zhuǎn)化子GS115/pPIC9K-scy-hep3，用體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達24 h，篩選高效表達菌株。

如圖3所示，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示，相對于誘導(dǎo)前的上清(第1泳道)，若干克隆(2～7泳道)誘導(dǎo)表達24 h后的發(fā)酵上清液中出現(xiàn)相對分子質(zhì)量大小約24 000的條帶，與預(yù)期的Scy-Hep3大小相符(畢赤酵母表達的擬穴青蟹抗菌肽Scygonadin表觀相對分子質(zhì)量大小約11 000[5]，原核表達的斜帶石斑魚抗菌肽Hepcidin 3相對分子質(zhì)量約12 000[6]，為目的蛋白條帶。如圖3箭頭所指，6號泳道的目的蛋白表達量最高，因此，收獲該株畢赤酵母高效表達菌株。

注：M1為DL2000 DNA Marker；M2為λHindⅢ DNA Marker；1為PCR擴增獲得實際大小560 bp的雜合抗菌肽scy-hep3目的基因片段；2為333 bp的scy成熟肽基因片段；3為245 bp的hep3基因片段；4為酶切前pPIC9K質(zhì)粒；5為9276 bp的經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后的pPIC9K；6～11分別為重組表達載體pPIC9K-scy-hep3的陽性克隆；12為陰性對照Note：M1，DL2000 DNA Marker; M2，λHindⅢ DNA Marker；1，PCR amplification of scy-hep3 gene 560 bp fragment; 2，scy mature gene with 333 bp; 3，hep3 gene with 245 bp; 4，pPIC9K; 5，pPIC9K digested with Eco RⅠand NotⅠ for 9276 bp; 6-11，positive clone of recombinant expression vector pPIC9K-scy-hep3; 12，negative control圖1 重組表達載體pPIC9K-scy-hep3的構(gòu)建與PCR鑒定Fig.1 Construction and PCR identification of recombinant expression vector plasmid pPIC9K-scy-hep3

圖2 pPIC9K-scy-hep3分泌型重組表達載體的構(gòu)建示意圖及推導(dǎo)的氨基酸序列組成Fig.2 Schematic representation of the secretion expression vector pPIC9K-scy-hep3 and deduced amino acid sequence of hybrid antimicrobial peptide Scy-Hep3

注：M為蛋白Marker；1為重組酵母轉(zhuǎn)化子GS115/pPIC9K-scy-hep3誘導(dǎo)前的發(fā)酵上清液；2～7泳道為隨機挑選的6個陽性克隆誘導(dǎo)表達24 h后的發(fā)酵上清液Note：M，protein maker；1，supernatant of positive strain GS115/pPIC9K-scy-hep3 culture before induction；2-7，supernatant of six strains of GS115/pPIC9K-scy-hep3 culture in 24 h induction 圖3 雜合抗菌肽Scy-Hep3在畢赤酵母中的分泌表達及高效表達菌株篩選Fig.3 Hybrid antimicrobial peptide Scy-Hep3 secreted expression in yeast Pichia pastoris and screening of highly expressed strains

2.4 雜合抗菌肽Scy-Hep3的表達和純化

將篩選獲得的重組畢赤酵母高效表達菌株GS115/pPIC9K-scy-hep3，用終濃度為0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達24 h后，收集分泌到胞外的上清液進行親和純化，用低濃度咪唑(10 mmol/L)的平衡緩沖液可洗脫掉雜蛋白(圖4，第3泳道)，用高濃度咪唑(250 mmol/L)的洗脫緩沖液可洗脫螯合的目的蛋白(圖4，第4、第5泳道)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明(圖4)，相對分子質(zhì)量約24 000的重組目的蛋白Scy-Hep3可特異性地與鎳離子金屬螯合層析柱結(jié)合，并在高濃度咪唑競爭洗滌后被洗脫。

注：M為蛋白Marker；1為重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-scy-hep3誘導(dǎo)前的發(fā)酵上清液；2為重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-scy-hep3誘導(dǎo)表達24 h后的發(fā)酵上清液；3為流出組分；4、5為洗脫組分Note：M，protein Maker；1，supernatant of GS115/pPIC9K-scy-hep3 culture before induction；2，supernatant of GS115/pPIC9K-scy-hep3 culture in 24 h induction；3，flow through fractions with 10 mmol/L imidazole; 4 and 5，elution fractions with 250 mmol/L imidazole圖4 雜合抗菌肽 Scy-Hep3的表達和純化Fig.4 Expression and purification of hybrid antimicrobial peptide Scy-Hep3

2.5 雜合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性

將純化后的雜合抗菌肽Scy-Hep3經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后，倍比稀釋蛋白濃度至1.5、3.0、6.0、12.0、24.0、48.0 μmol/L共6個濃度，與等體積的菌懸液混合培養(yǎng)1～2 d后觀察MIC結(jié)果。如表2所示，表達的雜合抗菌肽Scy-Hep3具有廣譜抗菌活性，能夠較好地抑制多數(shù)被測的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長，其中對3種革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、谷氨酸棒桿菌、溶壁微球菌和2種革蘭氏陰性菌如施氏假單胞菌、熒光假單胞菌的最小抑菌濃度均小于1.5 μmol/L，對2種革蘭氏陰性菌如嗜水氣單胞菌和弗氏志賀氏菌最小抑菌濃度為6～12 μmol/L，不抗蠟樣芽孢桿菌(MIC>48 μmol/L)?？咕囼灲Y(jié)果表明，畢赤酵母表達的雜合抗菌肽Scy-Hep3具有廣譜高效抗菌活性，雜合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性顯著高于單一的抗菌肽Scy和Hep3的抗菌活性。

表2 雜合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性Tab.2 Antimicrobial activities of Scy-Hep3

注：NT表示未檢測

Note：NT means undetected

3 討論

抗菌肽的研發(fā)與應(yīng)用，不僅具有重要的醫(yī)學(xué)開發(fā)前景，還是實現(xiàn)海水動物健康養(yǎng)殖、減少抗生素污染的重要保障。近年來，隨著對抗菌肽結(jié)構(gòu)功能及殺菌機理的深入研究，人們開始嘗試設(shè)計抗菌活性更強、抗菌譜更廣且穩(wěn)定性高的雜合抗菌肽。雜合抗菌肽可以提高單一抗菌肽的抗菌活性，同時降低溶血特性，因而有望發(fā)展成新型的抗菌藥物[9-10]。通過構(gòu)建雜合肽的工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽可降低其生產(chǎn)成本[11]。牛明福等[12]為了獲得抗菌活性較強的抗菌肽，將幾種抗菌肽串聯(lián)起來在畢赤酵母中表達，獲得的復(fù)合抗菌肽PL表現(xiàn)出了強于單獨的蝎子防御素SD的抗菌活性。

3.1 雜合抗菌肽Scy-Hep3的設(shè)計

本研究團隊前期對海洋魚類Hepcidin抗菌肽和青蟹Scygonadin抗菌肽等進行了系列研究[13]，其中Scy是從擬穴青蟹精漿中分離鑒定的一個新型陰離子抗菌肽，可能在青蟹的生殖免疫中起著重要作用。斜帶石斑魚Hep3屬于魚類Hepcidin家族的抗菌肽，Hepcidin 是魚類普遍存在的重要免疫防御因子[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，青蟹抗菌肽Scy和斜帶石斑魚抗菌肽Hep3的表達產(chǎn)物對細菌的抗菌活性與抗菌譜顯著不同[5-6]，例如，Hep3對金黃色葡萄球菌的抗菌活性顯著高于Scy，約為Scy抗菌活性的4倍；而Scy對水產(chǎn)致病菌嗜水氣單胞菌具有較強的抗菌活性，Hep3不抗嗜水氣單胞菌。鑒于青蟹抗菌肽Scy和石斑魚抗菌肽Hep3不同的抗菌譜，為獲得抗菌活性更強或抗菌譜更廣的抗海洋魚類和蟹類病原菌的融合多肽產(chǎn)品，本研究中將青蟹抗菌肽Scy和石斑魚抗菌肽Hep3在畢赤酵母中進行融合表達和抗菌活性分析。

3.2 連接肽的設(shè)計

合適的連接肽應(yīng)有足夠的長度和較高的柔韌性，不會影響融合蛋白中各個蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。設(shè)計連接肽時一般主要考慮氨基酸組成、連接肽長度、構(gòu)象、柔韌性等因素，連接肽中常用的氨基酸包括甘氨酸 (Gly)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)等，其中Gly作為相對分子質(zhì)量最小且親水性強的氨基酸使用最為廣泛，富含Gly使得連接肽柔軟易彎折[14-15]。蔡曉娜[16]通過體外重組表達了含不同連接肽的重組 TRAIL-Fc 融合蛋白，篩選獲得了通過連接肽(GGGGGGGG或THTSPPSP)連接的重組融合蛋白結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。趙昆等[17]使用連接肽(SPGS)將牛抗菌肽Bca7和Bca5融合表達，獲得的雜合抗菌肽比單一抗菌肽具有更高的抗菌活性。合適的連接肽能夠穩(wěn)定融合蛋白結(jié)構(gòu)，具有較好的生物學(xué)活性，但目前關(guān)于連接肽的研究還不夠深入，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，還需要更多的試驗設(shè)計和驗證。本研究中使用連接肽(GGPGSG)將擬穴青蟹抗菌肽Scy和攜帶石斑魚抗菌肽Hep3構(gòu)建融合抗菌多肽，主要利用Gly殘基無側(cè)鏈基團的柔軟效應(yīng)和Pro殘基的轉(zhuǎn)角效應(yīng)，認(rèn)為該柔性短肽有利于各自抗菌肽保持其穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)和相對獨立的抗菌活性。通過連接肽(GGPGSG)連接的重組雜合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性顯著高于單一的抗菌肽Scy和Hep3。但該連接肽設(shè)計的合理性和最優(yōu)性還需要通過表達不含連接肽或表達含不同連接肽的重組融合蛋白Scy-Hep3，并比較其抗菌活性才能得到進一步驗證。

3.3 雜合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性分析

雜合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性顯著增強可能是由于雜合抗菌肽拓展了單一抗菌肽的抗菌譜，還可能是由于畢赤酵母系統(tǒng)表達的目的蛋白有利于轉(zhuǎn)錄翻譯后的蛋白折疊加工成正確結(jié)構(gòu)的目的蛋白，從而有利于其抗菌活性的體現(xiàn)。雜合抗菌肽Scy-Hep3中的單一抗菌肽Hep3屬于抗菌肽Hepcidin家族，Hepcidin是一種富含半胱氨酸的兩性分子，可以通過二硫鍵形成穩(wěn)定的β折疊結(jié)構(gòu)和Loop結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與Hepcidin的抗菌活性密切相關(guān)[18]。一般通過畢赤酵母真核表達系統(tǒng)表達的具有這類特殊結(jié)構(gòu)的蛋白的抗菌活性要比用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得的表達產(chǎn)物抗菌活性強。如薛劍峰[19]用大腸桿菌表達系統(tǒng)和畢赤酵母表達系統(tǒng)表達了來源于中國明對蝦的對蝦素Chp5，畢赤酵母分泌表達的Chp5的抗菌效果與天然抗菌肽相近，而原核表達的Chp5抑菌活性不高，認(rèn)為是由于大腸桿菌表達系統(tǒng)不具有真核系統(tǒng)對翻譯后的蛋白進行修飾加工的作用，Chp5無法形成正確的二硫鍵結(jié)構(gòu)。本研究中通過畢赤酵母表達系統(tǒng)獲得了具有高抗菌活性的雜合抗菌肽Scy-Hep3，將為雜合抗菌肽的開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)資料。