吳莉婷 蘇雪 林俊生

（華僑大學醫(yī)學院，泉州362021）

核酸適配體，又稱適體（Aptamer），是一類短鏈的功能性寡核苷酸片段，可以是RNA、單鏈DNA，偶見報道為雙鏈DNA。適體在鹽溶液中形成凸環(huán)、發(fā)卡、假結、G-四堿基體等特殊的三維空間結構，在氫鍵、疏水作用力、范德華力等作用力下與靶標分子特異性結合［1］。適體與靶標分子結合特異性高且親和力強，解離常數(shù)范圍在10-12-10-9mol/L之間［2］，已被廣泛地應用于分析、檢測、治療、傳感器等多個領域［3］。作為功能性分子，適體在經過體外篩選后，需要對其特異性、穩(wěn)定性、親和力及與靶標間的相互作用等功能進行表征?，F(xiàn)階段常用的表征方法有點雜交、熒光免疫、流式細胞術和高效液相等。近年來，將適體作為識別分子應用于生物傳感器也顯示出了良好的應用前景［4］。石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance，QCM）是利用石英晶體的壓電效應，將電極表面的質量變化轉化為振蕩電路輸出的電信號頻率變化的一種生物傳感器，由于具有靈敏度高，檢測方便、迅速，裝置簡單，且在檢測過程中無需標記等優(yōu)點而得到重視［5］?，F(xiàn)今基于適體的QCM傳感器已經被用于小分子［6］、蛋白質［7］、細胞［8］、細菌［9］和病毒［10］等多種靶標的檢測，并表現(xiàn)出一定的普適性。此外，QCM還具有實時監(jiān)測，精確度高，穩(wěn)定性強及可再生等優(yōu)點［11］。因此，該技術被廣泛地應用于高靈敏度生物傳感器領域?；诖耍疚膶谶m體的石英晶體傳感器的相關研究及應用進行綜述，旨在為適體的篩選以及適體在基礎醫(yī)學、臨床診斷和疾病治療中的進一步應用提供參考。

1 基于適體傳感器的分類

從結構上來看，基于適體的生物傳感器主要由兩個部分組成：一是利用適體分子作為感受器，具有識別能力；二是信號轉換器，主要包括電化學信號轉換器、光學信號轉換器、壓電石英晶體轉換器等。當待測靶標分子與適體分子特異性結合后產生一個生物信號，適體傳感器通過信號轉換器將此信號轉變并放大為可以輸出的信號。

以電極作為換能器的電化學傳感器起步較早，是將檢測到的生物信號轉換為電信號的一種傳感系統(tǒng)，依據(jù)待測靶標與適體結合前后構象的變化，可以設計 Signal-off［12-13］和 Signal-on［14］兩種模式的適體電化學傳感器，前者出現(xiàn)結合后信號降低，而后者結合后信號增強，前者的靈敏度一般低于后者。目前來說，電化學生物傳感器技術相對成熟，應用廣泛。后期研究將其結合適體的特異性和親和力研制出一種新型的電流型電化學傳感器，用于針對凝血酶不同表位的兩種適體的檢測，最低可檢測出10 nmol/L的凝血酶［15-17］。另外，我國西南大學實驗室構建的基于殼聚糖/碳納米管/石墨烯/鐵氰化鎳（CS-CNTs-Gra-FP）納米復合材料的電化學適體傳感器用于檢測凝血酶適體也取得良好的結果。他們利用（CS-CNTs-Gra-FP）作為FP的固相載體，并結合金納米技術，此方法不僅增大了電極的比表面積、電子的傳輸速率，同時也增加了FP的固載量，從而極大的提高了該類適體傳感器的靈敏度，用來檢測凝血酶適體檢測限能達到3 pmol/L［18］。

光學生物傳感器是利用待測靶標與光發(fā)生相互作用時，光的一些參數(shù)會發(fā)生變化，通過檢測這些參數(shù)的變化，分析待測靶標的濃度和結構等特征來實現(xiàn)檢測的。光學適體傳感器可將適體識別得到的生物信號轉化為光學信號輸出，該技術可利用熒光、干涉、折射、表面等離子共振技術（Surface plasmon resonance technology，SPR）、橢偏、化學發(fā)光等多種方式進行檢測，同時根據(jù)所選的檢測材料的不同主要可分為光纖維適體傳感器、表面等離子共振適體傳感器、化學發(fā)光適體傳感器和熒光適體傳感器等。化學發(fā)光傳感器作為學科交叉與滲透的產物，成為近年來非?；钴S的研究領域，如酶基化學發(fā)光傳感器［19］、免疫化學發(fā)光傳感器［20］、化學發(fā)光反應同時作為分子識別反應的傳感器［21］等。嚴喜鸞等［22］利用基于適體生物傳感器的堿性磷酸酯酶化學發(fā)光檢測腺苷，該方法以羧基磁珠為固相載體，將腺苷適體與地高辛修飾過的腺苷適體互補序列固定到羧基磁珠的表面，檢測時先加入一定的待測靶標腺苷，再加入抗地高辛的堿性磷酸酯酶，用化學發(fā)光法檢測發(fā)光值，根據(jù)靶標加入前后化學發(fā)光的變化強度來定量腺苷濃度，結果顯示，在1.0×10-7-1.0×10-3mol/L范圍內，腺苷濃度的對數(shù)與發(fā)光強度呈線性關系（R2=0.976 9），檢測限能達到1.0×10-7mol/L。而Lee等［23］利用適體光纖生物傳感器定量檢測凝血酶與凝血酶適體的結合能力，檢測限低至10 nmol/L。

壓電晶體生物傳感器是利用晶體的壓電效應發(fā)展起來的，相對于之前的各種基于適體的生物傳感器具有實時在線監(jiān)測，靈敏度高，且不需要任何的標記，方便快捷的優(yōu)勢。此類傳感器的研究相對更多，如壓電免疫傳感器［24］、氰根離子壓電傳感器［25］、石英晶體微天平［26］等。其中壓電免疫傳感器是在壓電晶體的表面固定一層能與待測靶標特異性結合的適體，引起壓電晶體的頻率變化，根據(jù)頻率的變化數(shù)值來定量測定待測靶標的含量。氰根離子壓電傳感器是在鍍銀的石英晶體表面修飾一層硫化銀膜，該膜可選擇性的與氰根小分子適體結合，引起壓電晶體振蕩頻率的改變，此傳感器用以檢測水中的游離氰離子的線性范圍可達到2×10-5-0.02 μmol/L。石英晶體微天平則是利用石英晶體芯片一面的電極進行化學反應，此芯片表面同時為質量傳感器的傳感面，可用來在線跟蹤電極表面的質量變化。Abadian等［27］在芯片表面修飾了一層有代表性輸尿管支架表面的聚合物，隨后用尿素酶涂覆，以促進磷酸鈣和磷酸鎂的結晶，使用QCM定量檢測聚合物表面上晶體沉積的變化。

2 基于適體的石英晶體微天平傳感器基本原理

該技術以適體為感應元件，石英晶體芯片作為換能器，將芯片表面吸附物質的質量信號轉換為頻率信號，用于檢測適體與靶標間相互作用的一種質量敏感型壓電傳感器［28］。信號采集是在檢測過程中石英晶體受到交變電壓的影響產生振蕩電路，當振蕩頻率與石英晶體的固有頻率不一致時無法被記錄，只有當兩者的共振頻率一致時，晶體芯片的振動信號最大，從而被記錄。在一定條件下，當石英晶體表面吸附物質質量改變時，晶體固有頻率隨吸附質量的大小而改變，從而使得到的信號發(fā)生改變。1959年，Sauerbrey［29］研究表明，石英晶體表面質量負載與石英晶體頻率變化之間存在以下關系：

式中f0為石英晶體的基頻，A為石英晶體電極的有效面積，ρq為石英晶體密度，μq為石英晶體剪切模量，Δm為石英晶體表面的質量變化，負號表明表面質量增加引起石英諧振器頻率降低。由Sauerbrey方程可知，晶體表面質量變化與頻率變化存在線性關系?；谶m體的石英晶體微天平傳感器在晶體芯片表面固定適體作為特異性的感應元件，與靶標結合過程中引起芯片表面吸附質量增大，從而引起頻率下降，用于定性或者定量分析適體與靶標間的相互作用。

3 石英晶體微天平傳感器在適體功能性表征方面的應用

自1990年至今，已有大量適體被篩選出來，其靶標可分為小分子化合物、蛋白質、細胞、細菌、病毒及寄生蟲，甚至是特異性的組織［30］等，石英晶體微天平所具有的特性，使其逐步成為近年來適體與靶標相互作用的表征和用于構建高靈敏的適體石英晶體傳感器的方法之一。根據(jù)靶標的不同，現(xiàn)已應用于功能性表征的靶標主要為小分子或離子、蛋白質（圖1）、細胞或者細菌和病毒等，如表1所示。

4 石英晶體微天平傳感器在適體性能表征方面的優(yōu)缺點

石英晶體微天平技術作為微質量傳感器，它獨特的優(yōu)勢使得其被廣泛應用于化學、物理、生物、醫(yī)學和表面科學等領域中，用于進行待測物質的成分分析或者質量測定和黏彈性結構檢測等，它表現(xiàn)出來的在線跟蹤檢測過程的變化是其他方法無法比擬的，將其應用于適體與靶標的親和力表征中也同樣不可替代。

圖1 QCM用來表征蛋白質類靶標適體的示意圖

表1 基于適體的石英晶體微天平傳感器的部分應用

4.1 表征小分子靶標的優(yōu)勢

石英晶體微天平為質量依賴型傳感器，相對分子質量較小，需要構建高靈敏度的生物傳感器信號放大的過程必不可少。由于金納米顆粒的密度大，適體修飾的金納米顆粒易于修飾合成，故而金納米顆粒的放大作用在檢測中的使用最為廣泛［43］。Dong等［44］根據(jù) Hg2+與短鏈 HS-5′-（CH2）6-TTTT-3′能夠形成T-Hg（II）-T“三明治”結構的原理，并結合納米金顆粒等材料，構建了基于適體的QCM傳感器用于高敏檢測Hg2+。該技術檢測限可低至0.24 nmol/L，在特異性、可重復利用性不變的情況下，比Chen和Sheng等［45-46］構建的同類型的傳感器檢測限低一個數(shù)量級，比常規(guī)使用的比色法和熒光測定法高10-100倍。此外，Zheng等［47］結合金納米顆粒的放大作用，利用特異性核酸適體不僅與靶標分子可進行特異性結合，同時可與互補鏈形成雙鏈的特點，設計了末端帶有-SH修飾的核酸適體互補序列，構建了基于適體與腺苷和互補序列間競爭性結合腺苷特異性檢測QCM傳感器，在腺苷濃度為0-2 μmol/L時，存在較好的線性關系（R2=0.991 48）。與之相似，Dong等［33］利用了兩種兩端可形成雙鏈，中間部分均含茶堿特異性結合單元的RNA適體，利用QCM通過金納米顆粒的放大作用，構建了高靈敏度的茶堿的檢測方法，檢測限可降低至8.2 nmol/L。Song等［48］構建了一種酶循環(huán)放大信號的ATP基于適體的QCM傳感器，該方法延續(xù)了?zalp［32］基于適體QCM傳感器進行ATP定量檢測的高特異性，同時通過金納米顆粒和酶循環(huán)方法雙重方式進行信號放大，將檢測限由10 μmol/L降低至1.3 nmol/L，是原方法的近10 000倍。

4.2 表征蛋白質靶標的優(yōu)勢

以蛋白質為靶標的適體QCM傳感器應用較廣泛。首先，可用于適體使用條件的優(yōu)化，Hianik等［49］利用QCM 檢測適體濃度、鹽離子濃度、pH等因素對適體與凝血酶在芯片表面結合的影響，動態(tài)檢測了適體與凝血酶結合過程中各影響因素造成的結合行為變化。Nübel等［50］通過適體QCM檢測發(fā)現(xiàn)，特異性的腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNFα）適體趨向于與多聚體形式的TNFα進行特異性結合，破解了該適體與靶細胞親和力高但與靶蛋白的親和力較弱的謎題，為該適體后期的使用提供了較有力的理論依據(jù)。其次，可用于蛋白質高靈敏度的檢驗，Chen等［35］利用金納米粒的放大作用，運用適體QCM傳感器將凝血酶的檢測限由12.5 nmol/L降低至0.1 nmol/L，并在實際血清樣品中取得較好的檢測效果。另外，He等［51］通過金納米粒檢測技術和滾環(huán)擴增技術聯(lián)合使用，將凝血酶的檢測限降低至0.78 aM，可用于超高靈敏度的凝血酶檢測。

4.3 表征病毒靶標的優(yōu)勢

在病毒檢測方面，Brockman等［42］構建了基于適體的QCM傳感器用于檢測禽流感病毒H5N1，結合磁性納米微粒的信號放大作用，該傳感器的檢測限可達到1 HAU，并具有較高的特異性，同類型病毒H7N2、H9N2和H5N9等引起的信號響應均較小。此外，Wang等［52］結合高分子水凝膠技術，合成特異性的適體-高分子水凝膠復合物，固定在QCM表面后用于病毒的檢測，檢測限為0.0128 HAU，比Brockman的方法靈敏度高100倍，檢測時間也由1 h縮短為0.5 h。隨后，該團隊結合碳量子點技術，將檢測范圍由原來的0.0128-0.64 HAU提升至0.4-32 HAU，檢測時間有所縮短，并且該傳感器有非常好的穩(wěn)定性，存放96 d后其檢測性能依然較好［53］。

對于石英晶體微天平傳感器在適體性能表征方面的研究重點主要在于信號放大作用，但信號放大的過程中易造成非特異性偏差。本課題組正在利用QCM-D技術開展靶標為蛋白質的適體相關的實驗項目［54］，從目前的研究中推測：在使用QCM-D技術時需要特別關注的是蛋白質在芯片表面的非特異性吸附，所以不同的適體固定方法需要考慮添加不同的封閉劑進行封閉。現(xiàn)階段對于細胞、細菌和病毒相關基于適體的石英晶體微天平傳感器的報道較少，主要原因是這幾類靶標在石英晶體微天平檢測過程中易出現(xiàn)沉降現(xiàn)象及由于細胞等在溶液中可處于浮動狀態(tài)，與芯片上固定的適體直接結合時會出現(xiàn)信號響應過小的現(xiàn)象，本課題組也相應的進行了精子細胞與對應適體的結合力表征，并聯(lián)合顯微鏡等常規(guī)技術用以監(jiān)測精子細胞在石英晶體芯片上的動態(tài)過程，目前精子細胞作為靶標相關的數(shù)據(jù)處理模型仍處于研發(fā)狀態(tài)。因此，基于適體的石英晶體微天平傳感器的應用中需要對信號響應放大及減少非特異性吸附等方面進行改進。同時，QCM-D技術的使用價格稍貴，儀器設備需要小心維護。

5 展望

隨著該類傳感器越來越被學者關注，傳感器存在的以上問題正在被逐步解決，應用范圍也在逐漸擴大。適體化學成分可為DNA、RNA等，不僅可以用于適體與靶標結合行為的表征和高靈敏高特異性傳感器的構建，還可作為其他基于適體傳感器構建過程中輔助技術，常用于適體在傳感器表面固定量的實時檢測，并可與其他表征技術聯(lián)用，多方面進行分子間相互作用的表征。除此之外，QCM在檢測適體與靶標分子相互作用時越來越受到認可，可作為其他技術的驗證性方法。