肖星凝 朱龍佼 李相陽 羅云波 許文濤

（1. 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3. 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，北京 102206）

2002 年，Shagin等［1］從蝦、蟹等十足目動(dòng)物的消化腺或肝胰腺中分離得到一種DNA核酸酶，被稱為雙鏈特異性核酸酶（Duplex-specific nuclease，DSN）［2］。以往的實(shí)驗(yàn)多利用DSN酶為介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)miRNA［3］或構(gòu)建均一化全長(zhǎng) cDNA文庫［4］、 檢 測(cè) 單 核 苷 酸 多 態(tài) 性（Single nucleotide polymorphism，SNP）［1］、測(cè)定端粒長(zhǎng)度［5］等。目前，結(jié)合DSN酶對(duì)核酸鏈特有的性質(zhì)及生物傳感器快速、微量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，人們?cè)O(shè)計(jì)出了許多精確度越來越高的DSN酶介導(dǎo)的核酸生物傳感器，可以用來檢測(cè)不同種類的RNA、重金屬［6］、蛋白質(zhì)［7］等，使得DSN酶的運(yùn)用越來越廣泛。本文對(duì)近年來運(yùn)用DSN酶為介導(dǎo)的生物傳感器進(jìn)行了分類，旨在使人們更多的了解DSN酶在生物傳感器中的作用，指導(dǎo)人們有效、合理地設(shè)計(jì)和使用DSN酶介導(dǎo)的核酸生物傳感器。

1 DSN酶的介紹

1.1 DSN酶的結(jié)構(gòu)

Anisimova等［8］利用特定引物和cDNA末端快速 擴(kuò) 增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)，在堪察加半島蟹的肝胰臟中克隆了DSN基因并測(cè)定了它完整的初級(jí)結(jié)構(gòu)，還建立了一個(gè)有效的純化DSN酶的方法。DSN酶的初級(jí)結(jié)構(gòu)與著名的沙雷氏菌中的非特異性核酸酶相類似，但與其性質(zhì)不同，DSN酶能準(zhǔn)確地切割（或水解）雙鏈DNA 或是DNA/RNA雜交鏈中的DNA鏈，同時(shí)能保證單鏈DNA /RNA、單鏈的完整性；沙雷氏菌中的非特異性核酸酶卻是水解RNA和單、雙鏈DNA。

1.2 DSN酶的性質(zhì)

Anisimova等［8］、Qiu 等［2］對(duì) DSN 酶的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了總結(jié)。DSN酶蛋白是一種分子量為41.5 kD的單體，等電點(diǎn)為4.2。DSN酶活化需要加入鎂離子（至少5 mmol/L，最佳濃度為7 mmol/L），Ca2+并不能直接激活DSN酶，但能顯著增強(qiáng)Mn2+、Co2+和Mg2+對(duì)酶的激活能力，產(chǎn)生協(xié)同作用，同時(shí)，DSN酶活性隨離子濃度增加而降低。DSN酶是一個(gè)高度耐熱的酶，最適溫度60℃，在70℃下加熱30 min，DSN酶只會(huì)失去部分活性，即使是在100℃下加熱30 min，還會(huì)留有7%的活性［8］。有效pH值區(qū)間3-9，最佳pH值為6.6。EDTA能完全抑制酶活性，且DSN酶對(duì)多胺和離液劑比較敏感。DSN酶可以區(qū)分完全互補(bǔ)配對(duì)和不完全互補(bǔ)配對(duì)的雙鏈雜交物，能實(shí)現(xiàn)單堿基區(qū)分。底物長(zhǎng)度要求：DNA雙鏈中最小 9 bp［8］或 10 bp［2］DNA，較短的 DNA 雙鏈不會(huì)被切割，保留完整，DNA/RNA雜交雙鏈的有效切割長(zhǎng)度為 15 bp［2］。

1.3 DSN酶的切割產(chǎn)物

Liu等［9］在利用DSN酶對(duì)SNP進(jìn)行無標(biāo)記檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)中，闡述了當(dāng)檢測(cè)樣品中的正常序列與探針完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，可被DSN酶降解為dNMPs，dNMPs是含有一個(gè)磷酸的單核苷酸，驗(yàn)證了DSN酶可能將底物雙鏈DNA水解成單個(gè)核苷酸，且沒有位點(diǎn)的切割，降解部位可能為磷酸二酯鍵。

Anisimova等［8］使用放射性同位素分別標(biāo)記含有7、8、9 nt的單鏈DNA，再將這3條單鏈DNA分別與沒有標(biāo)記的含43 nt的核苷核酸鏈雜交，用DSN酶去水解發(fā)現(xiàn)只有被標(biāo)記的含9 nt的雙鏈DNA能被正常水解，且電泳圖顯示，水解產(chǎn)生較多的3、5 nt的核苷酸小片段。同時(shí)，Zhao等［5］利用DSN酶測(cè)量端粒長(zhǎng)度，其原理主要是DSN酶能將雙鏈染色體切割成了小于10 bp的碎片，使單鏈的端粒保留完整，從而測(cè)量其長(zhǎng)度。所以，由DSN酶切割所得的產(chǎn)物可能是由大部分短核苷酸鏈和小部分單核苷酸組成。Zhao等［5］還檢測(cè)了DSN酶切割剩余片段長(zhǎng)度，設(shè)計(jì)了16 bp長(zhǎng)的雙鏈DNA加18 nt長(zhǎng)的單鏈，其中單鏈重復(fù)TTAGGG序列。經(jīng)DSN酶水解后，除了發(fā)現(xiàn)了一個(gè)長(zhǎng)為24 nt的核苷酸鏈，比實(shí)際設(shè)計(jì)的懸臂模板長(zhǎng)了6 nt。說明了在雙鏈區(qū)域有5-6個(gè)核苷酸仍然未被降解，不管16 nt DNA片段是否含有75%或25%的GC含量，表明這個(gè)消化的限度是獨(dú)立的，不會(huì)進(jìn)行特異性識(shí)別堿基對(duì)序列的切割。

2 DSN酶介導(dǎo)的檢測(cè)miRNA的光學(xué)傳感器

2.1 比色傳感器

比色法是通過觀察體系中溶液顏色的變化來判斷樣液中是否含有靶物質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)是用肉眼即可看出顏色的變化，但不足之處是精確度不高，所以如需定量，可以使用核酸信號(hào)放大方法。

Wang等［10］利用A、B兩條探針去檢測(cè)miRNA，當(dāng)90℃溫度下加熱5 min，達(dá)到解旋目的，如果有miRNA，則B探針會(huì)與之結(jié)合，加入的DSN酶會(huì)把B探針?biāo)獾?，只剩下A探針，這時(shí)A探針就會(huì)使金納米聚沉，從紅色變?yōu)樗{(lán)色，達(dá)到檢測(cè)目的；反之，如果沒有miRNA，A、B探針就會(huì)隨溫度下降再次結(jié)合，就不會(huì)使金納米變色，檢測(cè)限為20 pmol/L-1 nmol/L。Xia等［11］利用金納米特性設(shè)計(jì)了單探針檢測(cè)miRNA，然后最先提議的比色法轉(zhuǎn)變成了電化學(xué)法，達(dá)到了更低的檢測(cè)限，檢測(cè)范圍為0-25 fmol/L，最低檢測(cè)限為0.1 fmol/L。

2.2 熒光傳感器

熒光法檢測(cè)因?yàn)轫憫?yīng)快速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，成為了一種較常用的檢測(cè)技術(shù)［12］，我們將以不同表達(dá)方式的物質(zhì)分類的熒光傳感器進(jìn)行介紹。

2.2.1 在納米網(wǎng)熒光傳感器中的應(yīng)用 Guo等［13］設(shè)計(jì)了利用氧化石墨烯納米網(wǎng)可以淬滅熒光來檢測(cè)miRNA，帶有熒光基團(tuán)的單鏈探針DNA與miRNA結(jié)合以后，就能被DSN酶降解，釋放出熒光基團(tuán)而發(fā)出熒光；若沒有miRNA，探針DNA則不會(huì)被降解，就會(huì)被吸附到石墨烯上，熒光會(huì)被淬滅，最低檢測(cè)限是160 fmol/L。Xi等［14］首次利用WS2納米網(wǎng)來檢測(cè)miRNA，原理和Guo等［13］設(shè)計(jì)的一樣，不過是WS2納米網(wǎng)代替氧化石墨烯來淬滅單鏈探針DNA上的熒光基團(tuán)，檢測(cè)限擴(kuò)大到了300 fmol/L。

2.2.2 在磁性粒子熒光傳感器中的應(yīng)用 Hao等［15］設(shè)計(jì)了一種雙重信號(hào)放大的檢測(cè)法檢測(cè)miRNA，如圖1。單鏈DNA探針分為藍(lán)色的miRNA識(shí)別探針和綠色的帶有熒光基團(tuán)的轉(zhuǎn)換探針兩部分，首先，識(shí)別探針與miRNA完全互補(bǔ)配對(duì)后，DSN酶將識(shí)別探針切成碎片，進(jìn)而熒光基團(tuán)連同綠色轉(zhuǎn)換探針從磁珠上切離下來，游離到溶液中，同時(shí)靶標(biāo)miRNA也釋放到溶液中與磁珠上新的捕獲探針進(jìn)行結(jié)合，最終，一個(gè)miRNA可以釋放多個(gè)轉(zhuǎn)換探針，DSN酶切割完成后，利用磁場(chǎng)，將磁珠上未釋放的熒光基團(tuán)從溶液中分離出來，溶液的熒光強(qiáng)度與被釋放的轉(zhuǎn)換探針數(shù)量有關(guān)，即與靶分子數(shù)量成正相關(guān)，可以通過熒光強(qiáng)度初步對(duì)靶標(biāo)miRNA進(jìn)行定量（圖1-A）。當(dāng)分析物濃度過低，熒光強(qiáng)度無法準(zhǔn)確識(shí)別時(shí)，本法又設(shè)計(jì)了電化學(xué)傳感進(jìn)行二次信號(hào)放大（圖1-B），主要是通過轉(zhuǎn)換探針催化組裝固定在電極上的發(fā)卡探針進(jìn)行取代反應(yīng)，將熒光信號(hào)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增為電信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。具體轉(zhuǎn)化擴(kuò)增路徑如下：鎘納米粒子黏附在玻璃碳電極上，發(fā)卡H1連接在鎘納米粒子上，轉(zhuǎn)換部位的探針將與H1互補(bǔ)，使H1展開，露出H1的莖，另一個(gè)發(fā)夾H2與露出的H1莖互補(bǔ)配對(duì)，釋放出轉(zhuǎn)換部位的探針，再次達(dá)到循環(huán)目的。進(jìn)行充足擴(kuò)增以后，H1-H2復(fù)合體就能抓住連有多個(gè)G-四聯(lián)體/氯高鐵血紅素的具有DNA酶功能化的磁珠，導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光減少，這樣的H1-H2復(fù)合體數(shù)量取決于轉(zhuǎn)換部位的數(shù)量。

圖1 熒光檢測(cè)miRNA的原理示意圖［15］

Zhang等［16］設(shè)計(jì)了一種無標(biāo)記的miRNA檢測(cè)方法，單鏈DNA探針通過鏈霉親和素和生物素連接在小磁珠上，探針分為兩部分，下部分可與miRNA結(jié)合，被DSN酶切割，然后釋放出的上部分探針單鏈DNA與Tb3+結(jié)合，使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

Lv等［17］又設(shè)計(jì)了一種可以雙重信號(hào)擴(kuò)增檢測(cè)miRNA的方法，其最低檢測(cè)限為7.3 fmol/L，miRNA來源于人體癌細(xì)胞，磁半球上連接的探針由兩部分組成，下部分為DNA，上部分為2-OMe-RNA，第一次信號(hào)擴(kuò)增是由miRNA與下部分的DNA結(jié)合，DSN酶切碎DNA，釋放出miRNA和剩余的2-OMe-RNA部分，磁半球被磁鐵吸附，只剩2-OMe-RNA；第二次信號(hào)擴(kuò)增，帶有熒光基團(tuán)的Taqman探針可與2-OMe-RNA結(jié)合，再次被DSN酶切割，發(fā)出熒光，達(dá)到雙重檢測(cè)的目的。

2.2.3 在金納米粒子熒光傳感器中的應(yīng)用 2016年，Xu等［18］設(shè)計(jì)了一種可以同時(shí)檢測(cè)多種miRNA的方法，將具有3D結(jié)構(gòu)、不同顏色的熒光染料標(biāo)記的四面體DNA探針固定在金納米粒子上，靶物質(zhì)可以是miRNA-16、miRNA-21、miRNA-26a，與之對(duì)應(yīng)的DNA探針結(jié)合，即可被DSN酶切碎，釋放出不同顏色的熒光物質(zhì)，同時(shí)還能區(qū)別1個(gè)堿基、3個(gè)堿基錯(cuò)配的情況。

2.3 化學(xué)發(fā)光傳感器

2016年，Wang等［19］發(fā)明一種化學(xué)發(fā)光傳感器，如圖2，使用聚多巴胺（PDA、能量受體）-納米半球?yàn)槊浇椋瑢?shí)現(xiàn)共振能量轉(zhuǎn)換，此法不需要有機(jī)染料或者任何標(biāo)記。整個(gè)反應(yīng)體系包括了檢測(cè)探針、聚多巴胺、氯高鐵血紅素、魯米諾、H2O2和DSN酶，該檢測(cè)探針由一個(gè)與miRNA堿基對(duì)互補(bǔ)的單鏈DNA和一個(gè)G-四聯(lián)體-氯高鐵血紅素DNA酶兩個(gè)部分組成，首先當(dāng)有miRNA時(shí)，就會(huì)與DNA探針結(jié)合，DSN酶切碎探針后，釋放出的G-四聯(lián)體-氯高鐵血紅素就會(huì)和H2O2發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使魯米諾發(fā)光，實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光，但此時(shí)不發(fā)生能量共振傳遞；但沒有靶標(biāo)存在下，G-四聯(lián)體不會(huì)剝離下來，加入過氧化氫、魯米諾發(fā)光，但同時(shí)，會(huì)和多巴胺納米球發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，化學(xué)光被淬滅。檢測(cè)限范圍為80 pmol/L-50 nmol/L，最低檢測(cè)值為49.6 pmol/L。

圖2 化學(xué)發(fā)光傳感器的檢測(cè)miRNA原理圖

2.4 表面增強(qiáng)拉曼光譜傳感器

Pang等［20］將Cy3-DNA修飾到Fe3O4@Ag-磁納米粒子上，該磁納米粒子以Fe3O4為中心粒子，溶解于PEI活性劑溶液中，可吸附一層金，再?gòu)腜VP活性劑和硝酸銀溶液中置換出銀，給磁納米粒子外面包裹上一層銀外殼，其形成過程如圖3。表面增強(qiáng)拉曼散射光，同時(shí)，DSN酶信號(hào)擴(kuò)增。首先，miRNA被DNA探針捕獲，形成可被DSN酶切割的DNA-RNA雜交雙鏈。DSN酶切后，產(chǎn)生Cy3-DNA碎片，且不停地釋放miRNA，激發(fā)信號(hào)擴(kuò)大循環(huán)。然后，用磁鐵濃縮溶液，Cy3-DNA碎片被清洗，即可讀出拉曼指數(shù)。基于Fe3O4@Ag-磁納米粒子的超順磁效應(yīng)，miRNA let-7b無需PCR，可被DNA探針直接捕獲。最低檢測(cè)限為0.3 fmol/L，比傳統(tǒng)的熒光法檢測(cè)miRNA（- 100 fmol/L）低了3個(gè)數(shù)量級(jí)。

3 DSN酶介導(dǎo)檢測(cè)miRNA的電化學(xué)傳感器

熒光傳感器雖然簡(jiǎn)便、易操作，但對(duì)環(huán)境要求較嚴(yán)格，相比之下，電化學(xué)傳感器的檢測(cè)靈敏度更高、且易于微型化和集成化，在未來具有很好的研究前景［21］。

圖3 Fe3O4@Ag-磁納米粒子的形成過程

3.1 金電極修飾傳感器

Zhang等［22］設(shè)計(jì)了一個(gè)光電化學(xué)傳感器，其分為連續(xù)的兩部分，上邊黑色部分是具有識(shí)別序列的單探針，硫醇在5′末端，下面藍(lán)色部分為2′-O-甲基修飾富含G堿基序列，通過硫-金共價(jià)物，連接在金電極上，miRNA將與黑色部分單探針結(jié)合，被DSN酶切碎后，釋放出的miRNA循環(huán)數(shù)次，直到金電極上僅剩2′-O-甲基修飾富含G堿基的序列可與加入氯高鐵血紅素結(jié)合形成2′-O-甲基修飾G-四聯(lián)體-氯高鐵血紅素，催化H2O2反應(yīng)，與TMB發(fā)生變色，增強(qiáng)電流信號(hào)，該傳感器的檢測(cè)限為8 amol/L miR-21。2017年，Lu等［23］設(shè)計(jì)了一種雙重信號(hào)擴(kuò)增檢測(cè)的方法，首先小磁珠上修飾著由兩部分組成的單鏈DNA探針，下面綠色部分可與需要檢測(cè)的靶物質(zhì)結(jié)合，然后DSN酶切割，釋放出剩余上面藍(lán)色單鏈DNA部分，離心后，獲得上清液，藍(lán)色的單鏈DNA可與修飾在金電極上的單鏈DNA結(jié)合，此時(shí)再加入兩個(gè)發(fā)卡探針H1、H2，是H1、H2展開形成網(wǎng)狀與阿霉素磷酸鹽結(jié)合可形成量子點(diǎn)產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。檢測(cè)let-7d的范圍為10 amol/L-10 nmol/L，最低檢測(cè)限為 10 amol/L。Liu等［24］也是利用DNA探針修飾在金納米上的原理設(shè)計(jì)了一種較復(fù)雜的電化學(xué)方法檢測(cè)miRNA，最低檢測(cè)限是0.2 fmol/L。

3.2 玻璃碳電極修飾傳感器

2016年，Zhang等［25］設(shè)計(jì)了一個(gè)利用鏈霉親和素-生物素結(jié)合，DSN酶介導(dǎo)的靶物質(zhì)循環(huán)，富集捕獲探針，磁小珠吸附到玻璃碳電極上，產(chǎn)生相應(yīng)電阻的傳感器。捕獲探針一端接有生物素，下面部分探針與miRNA雜交后，可以被DSN酶切碎，釋放出的生物素可與磁小珠上的鏈霉親和素結(jié)合，但因?yàn)樯锼厣系腄NA探針太短，陰極帶電層不能形成，就會(huì)產(chǎn)生較小的電荷轉(zhuǎn)移電阻；當(dāng)沒有miR-21時(shí)，探針將無法雜交，DSN酶不會(huì)水解單鏈DNA，因此，完整的探針可以吸附到玻璃碳電極表面，產(chǎn)生一個(gè)緊密的陰極電層，產(chǎn)生較大電子轉(zhuǎn)移電阻。上述的實(shí)驗(yàn)方案達(dá)到了超靈敏檢測(cè)，miR-21檢測(cè)限為 60 amol/L。Hao 等［26］、Shuai等［27］也利用了玻璃碳電極修飾傳感器用來檢測(cè)miRNA，Hao等運(yùn)用了DSN酶、金納米、魯米諾-金納米和半導(dǎo)體納米晶體等介導(dǎo)，能量發(fā)生共振轉(zhuǎn)移。Shuai等使用了結(jié)合鏈霉親和素堿性磷酸酶、DSN酶等介導(dǎo)。

3.3 ITO電極修飾傳感器

ITO電極就是銦錫氧化物玻璃電極。Fu等［28］設(shè)計(jì)了一個(gè)ITO電極修飾的傳感器檢測(cè)miR-10b，電擊上帶有負(fù)電荷，DNA探針一段帶有亞甲基藍(lán)，與miR-10b結(jié)合以后，可被DSN酶切碎，釋放出帶亞甲基藍(lán)的碎片可與電極之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電流電壓；反之，如果沒有靶物質(zhì)的存在，亞甲基藍(lán)就無法與ITO電極傳遞電子。Li等［29］也使用了ITO電極及DSN酶，運(yùn)用光電化學(xué)的原理來檢測(cè)miRNA。

4 DSN酶介導(dǎo)檢測(cè)miRNA的光磁傳感器

Tian等［30］利用光磁效應(yīng)檢測(cè)兩種不同的miRNA，他們?cè)O(shè)計(jì)了一種組裝磁納米結(jié)構(gòu)，內(nèi)核是磁小珠，不同顏色的單鏈DNA探針連接在磁珠不同的層面，所以當(dāng)miRNA與探針結(jié)合，被DSN酶切碎后，釋放出的磁性納米顆粒，光磁設(shè)備將會(huì)檢測(cè)車這些磁性納米顆粒的數(shù)量。光磁傳感器將記錄二次諧波，透射光密度及頻率。對(duì)于單定位點(diǎn)檢測(cè)let-7b，可觀察到檢測(cè)限在10 fmol/L - 10 nmol/L之間，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行70 min時(shí)，最低檢測(cè)限可為4.8 fmol/L（圖 4）。

5 DSN酶介導(dǎo)檢測(cè)其他物質(zhì)的生物傳感器

5.1 檢測(cè)重金屬Hg2+的應(yīng)用

具有功能性的核酸生物傳感器在檢測(cè)重金屬領(lǐng)域中體現(xiàn)出越來越重要的地位，因?yàn)樗鼈兙哂幸撞僮?、價(jià)格較便宜的特點(diǎn)。2017年，Ou等［7］就借助DSN酶介導(dǎo)設(shè)計(jì)了一種通過熒光檢測(cè)重金屬Hg2+的簡(jiǎn)單的生物傳感器，核酸探針上只有熒光團(tuán)，沒有淬滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)后的序列可以對(duì)折互補(bǔ)，里面有T-T堿基錯(cuò)配，DSN酶就不可以切割；當(dāng)加入Hg2+后，Hg2+將兩個(gè)不互補(bǔ)的堿基連接在一起形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，熒光峰值增加到137%；此時(shí)，再加入DSN酶，核酸鏈被切碎，釋放出熒光基團(tuán)，熒光峰值增加到了1251%。這種實(shí)驗(yàn)方法高效、簡(jiǎn)單，可準(zhǔn)確的檢測(cè)水樣中或生物細(xì)胞內(nèi)的Hg2+濃度。

圖4 光磁傳感器檢測(cè)miRNA的工作原理

5.2 檢測(cè)蛋白質(zhì)的應(yīng)用

Yuan等［6］使用電化學(xué)的方法檢測(cè)家蠶微孢子全蛋白，首先在Au@Fe3O4粒子（即一層金附著在Fe3O4粒子上的結(jié)合物）上修飾A1單鏈DNA，Ab標(biāo)記的探針S1與A1完美互補(bǔ)，根據(jù)鄰近效應(yīng)，加入的靶物質(zhì)家蠶微孢子全蛋白與S1、S2產(chǎn)生一種三明治結(jié)構(gòu)，暴露出的A1單鏈DNA可與H1、H2、亞甲基藍(lán)發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，再經(jīng)過DSN酶切割以后，釋放出金屬離子、亞甲基藍(lán)、Ab，然后磁鐵吸附金屬離子，取上清液，得到的亞甲基藍(lán)溶液和電極之間發(fā)生電子傳遞，從而通過檢測(cè)電流達(dá)到檢測(cè)家蠶微孢子全蛋白的目的（圖5）。

圖5 檢測(cè)蛋白質(zhì)的工作原理

5.3 檢測(cè)mRNA的應(yīng)用

2015年，Li等［31］設(shè)計(jì)了一種雙信號(hào)擴(kuò)增的方法檢測(cè)mRNA，整個(gè)設(shè)計(jì)由兩部分組成，探針S1連接在磁性納米顆粒5′端上，生物條碼連接在3′端，即S1上的末端連接金納米粒子，金納米上再連接修飾了CdS納米粒子的序列S2，形成了MNPs-S1-AuNPs-S2-CdS NP傳感體系，當(dāng)靶物質(zhì)mRNA與S1結(jié)合后，形成可被DSN酶切割的雙鏈，酶切以后，金納米粒子和由S2連接在一起的CdS納米粒子被釋放出來，當(dāng)有超過100個(gè)CdS連接在金納米上時(shí)，實(shí)驗(yàn)靈敏度就會(huì)大大增加。當(dāng)納米粒子被HNO3溶解20 min后，然后用溶出伏安法測(cè)量。這種方法具有很靈敏的檢測(cè)能力，最低檢測(cè)限是0.48 fmol/L（圖 6）。

6 不同方法的檢測(cè)限對(duì)比

不同DSN酶介的生物傳感器主要是用來檢測(cè)miRNA，從表1中可以看出，使用電化學(xué)傳感器明顯比光學(xué)傳感器更加靈敏。在電化學(xué)傳感器中，金電極修飾和玻璃碳電極修飾的傳感器相對(duì)于其他的電化學(xué)傳感器能檢測(cè)到濃度更低的目標(biāo)物質(zhì)；在光學(xué)傳感器中，表面增強(qiáng)拉曼光譜傳感器的檢測(cè)限最低，表明它的靈敏度較高，但不如電化學(xué)傳感器。

7 結(jié)語

目前，DSN酶切割的具體方式還沒完全闡述清楚，而且，對(duì)DSN酶的一些性質(zhì)也不太清楚，需要更多的研究，如DSN最大切割限度，將擴(kuò)大DSN酶的應(yīng)用范圍。同時(shí)，目前對(duì)新興的核酸或者人工核酸的作用探索較少，使用DSN酶介導(dǎo)的生物傳感器主要應(yīng)用于檢測(cè)miRNA，通過采用不同檢測(cè)原理如比色法、熒光法、電化學(xué)法等，借助金納米粒子、小磁珠等物質(zhì)來放大檢測(cè)信號(hào)，設(shè)計(jì)巧妙，但我們發(fā)現(xiàn)DSN酶仍可應(yīng)用于檢測(cè)重金屬和蛋白質(zhì)等物質(zhì)中，而且這方面應(yīng)用較少，所以這可能是未來的研究趨勢(shì)。

圖6 檢測(cè)mRNA的工作原理

表1 不同DSN酶介生物傳感器檢測(cè)方法的比較

常用的方法中，比色法雖然直觀，但精密度較低，可能只適用于miRNAs 的定性檢測(cè)，無法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量低濃度的miRNAs。而化學(xué)發(fā)光等這類檢測(cè)方法應(yīng)該是比較新穎，可顯著提高檢測(cè)miRNAs的靈敏度和特異性。盡管電化學(xué)傳感器檢測(cè)方便、快速，但是其對(duì)檢測(cè)平臺(tái)的穩(wěn)定性要求較高，尤其是電極的加工工藝和探針的包被技術(shù)直接影響了電化學(xué)傳感器的應(yīng)用前景［32］。同時(shí)檢測(cè)幾種物質(zhì)成為最近設(shè)計(jì)生物傳感器的主要趨勢(shì)，為了檢測(cè)更低限度的物質(zhì)，多重檢測(cè)信號(hào)擴(kuò)增也是未來發(fā)展方向，而且，我們可以合理地利用金納米等其他有助于提高檢測(cè)限度的納米物質(zhì)。