張倩 田晶晶，2 羅云波，2 許文濤，2

（1. 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部轉基因生物食用安全重點實驗室（北京），中國農(nóng)業(yè)大學，北京 100083）

生物納米機器是天然或人為設計的組件，它們受環(huán)境變化所產(chǎn)生的物理或化學刺激而使結構或構象發(fā)生變化。生物納米機器可以用作傳感器、馬達或用于體外基因表達的邏輯分析［1-2］。最初的生物納米機器是天然的內(nèi)源蛋白質(zhì)，如驅(qū)動蛋白、動力蛋白、肌球蛋白、旋轉分子馬達、DNA解旋酶及RNA聚合酶等［3-5］，它們通過構象的變化將三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）水解產(chǎn)生的化學能轉化成機械能，從而實現(xiàn)各種功能。受蛋白質(zhì)馬達的啟發(fā)，利用沃森-克里克氫鍵的特異性和可預測性，構建了核酸納米機器。核酸分子除了能夠攜帶遺傳信息以外，單鏈DNA能夠自我折疊成復雜的三級結構，成為具有特異性識別能力以及催化活性的功能核酸。功能核酸的特性由其堿基序列中的編碼信息決定，這些堿基可依照沃森-克里克堿基互補配對原則形成不同的結構，如雙鏈體、超分子交叉磚、G-四鏈體、C-四鏈體（i-motifs）、堿基-金屬-離子復合物等（圖1）［3］。功能核酸納米機器是天然或人工設計的通過核酸堿基序列特異性相互作用而自組裝形成的核酸組件。關于功能核酸納米機器的研究越來越多（圖2），功能核酸納米機器的運轉可通過兩種方式使其結構或構象發(fā)生轉化而被激活，一種方式是功能核酸與特定信號分子相互作用使其結構發(fā)生變化；另一種方式是在外界環(huán)境的刺激下（如改變pH、加入離子、用不同的光照射等）使功能核酸構象發(fā)生變化。目前，功能核酸納米機器的表征方法主要有：熒光光譜分析法、凝膠電泳法、透射電子顯微鏡觀察法、掃描電鏡觀察法、原子力顯微鏡觀察法、動態(tài)光散射技術及圓二色譜法。

圖1 核酸不同的結構示意圖

圖2 功能核酸納米機器發(fā)展歷程圖

本文總結了經(jīng)典的功能核酸納米機器，如G-四鏈體功能核酸介導的、適配子功能核酸介導的、脫氧核酶介導的、霍利迪結功能核酸介導的、基于非金屬、金屬材料的、鏈置換的、點擊反應的、三螺旋核酸的、pH響應的、光誘導的功能核酸納米機器。繼而介紹了功能核酸納米機器在藥物靶向遞送、生物成像的應用。最后展望了功能核酸納米機器的應用前景及可能遇到的挑戰(zhàn)。

1 G-四鏈體功能核酸介導的納米機器

G-四鏈體（G-quadruplexes）是一種特殊的DNA結構，是由富G的核酸序列中4個鳥嘌呤（Guanine，G）兩兩間形成2個霍氏（Hoogsteen）氫鍵圍成的正方片層堆疊而成［5］。當G-平面堆疊形成G-四鏈體時，需要金屬離子的穩(wěn)定，尤其是堿金屬離子，如K+、Na+等。這些金屬離子位于G-平面的中心，與鳥嘌呤的O6有靜電作用，因此可利用G-四鏈體的這種特性來構建核酸納米機器。

2002年，佛羅里達大學的Tan［6］課題組和法國的Mergny［7］課題組先后利用G-四鏈體設計出了DNA分子馬達。該馬達由一條富G的單鏈DNA組成，在馬達兩端分別修飾熒光基團和淬滅基團，通過熒光信號強度變化表征馬達的運轉。在K+、Na+、Li+鹽溶液中該單鏈DNA自組裝折疊成G-四鏈體結構，此時5′和3′端靠近，熒光被淬滅；當加入富C的燃料鏈，其會與富G鏈配對結合形成穩(wěn)定的雙鏈結構，此時5′和3′端遠離，熒光恢復。當再加入富G的燃料鏈通過鏈置換反應與富C鏈結合成廢棄的雙鏈，DNA又回到四鏈結構。這種G-四鏈體納米機器實質(zhì)是基于鏈置換反應，所以這類機器的效率和壽命有限。

G-四鏈體還可搭建在納米孔平臺上，Hou等［8］利用該特性，通過調(diào)節(jié)K+濃度來調(diào)節(jié)G-四鏈體結構的穩(wěn)定性，然后誘導有效孔徑的變化，進而控制膜的孔隙的離子滲透性。通常固定的DNA鏈以柔性的隨機卷曲狀態(tài)存在，這允許離子自由擴散進出；在K+存在的情況下，促進了G-四鏈體的形成，壓縮的結構有效地阻止了離子轉移；去除鉀離子后，四鏈體展開成柔性單鏈，恢復了通過膜的滲透性。

此外，G-四鏈體廣泛構建在電化學平臺上組裝成納米機器，Wu等［9］將富G的核酸鏈一端用硫醇修飾，固定在金電極表面，二茂鐵衍生物偶聯(lián)到核酸鏈末端，用作電化學標記，在不存在K+的情況下二茂鐵衍生物（Fe）和金電極之間有良好的電子轉移，在K+存在下核酸組裝成G-四鏈體，在得到的剛性結構中，二茂鐵衍生物與電極在空間上分離，使得幾乎沒有任何電子轉移。

2 適配體功能核酸介導的納米機器

適配體是能夠通過特定的構象來靶向特定的分子的單鏈DNA或RNA。其通過分子間作用力（如氫鍵、范德華力和靜電力等）與目標分子結合，并具有高度的親和力和選擇性［10-11］，可以媲美抗體的優(yōu)勢。適配體是通過SELEX體外篩選得到的［12］，可以結合所選擇的任何目標，應用范圍廣。此外，適配體還具有設計靈活性、易于改性、化學穩(wěn)定性和快速的組織滲透等優(yōu)點。

Banerjee等［13］設計了一種新型DNA二十面體，可以由環(huán)鳥苷二磷酸（Cyclic guanosine diphosphate，cdGMP）外刺激，從中線劈裂成兩部分，釋放里面裝載的分子貨物。設計的該cdGMP刺激響應型DNA二十面體，是通過在傳統(tǒng)的二十面體的連接處中引入cdGMP的核酸適配體實現(xiàn)的。cdGMP 是細菌里的一種二級信使（內(nèi)生性分子）可以調(diào)控信號傳導進程，與細菌的生命形式及代謝形式息息相關。當cdGMP存在時，cdGMP與適配體結合引起適配體構象變化，觸發(fā)鏈置換導致DNA二十面體解離成兩半，使得內(nèi)部裝載的貨物釋放出來。該研究用熒光左旋糖苷作為模式裝載物，因此可以用熒光檢測裝載貨物的釋放情況。這種適配體嵌入的二十面體，能通過改變適配體類型與多種生理分泌型分子信號相結合，在不同的生理環(huán)境中實現(xiàn)空間或時間可控的貨物釋放，對于體內(nèi)可控分子遞送具有一定的指導意義。

3 脫氧核酶功能核酸介導的納米機器

這類功能核酸納米機器都有脫氧核酶的參與，脫氧核酶（DNAzyme）是一種能特異結合并切割RNA或DNA分子的功能核酸DNA，具有高效的催化降解能力。DNAzyme具有容易制備，對于化學降解和酶降解不敏感等優(yōu)點［14-15］。8-17DNAzyme和10-23DNAzyme［16］以及它們的變體是研究最多以及應用最廣泛的兩類DNAzyme。DNAzyme有類似于酶的催化活性［17］，在金屬離子的作用下可以對底物鏈的rA位點切割，底物鏈斷裂，通過熒光標記的熒光信號或者是產(chǎn)生電化學信號的改變對靶標物質(zhì)的含量進行檢測。

近年來，基于脫氧核酶的功能核酸納米機器的研究越來越多，該類納米機器種類也豐富多樣。有結合鏈置換反應形成雙鏈后將DNAzyme酶鏈釋放使其結合底物鏈，從而使得機器運轉，Peng等［18］基于此構建了一種檢測細胞內(nèi)miRNA的納米機器，其原理是首先將脫氧核酶運動系統(tǒng)構建在金納米粒子（Au nanoparticles，AuNP）上，AuNP被數(shù)百個底物鏈和幾十個DNAzyme分子官能化，每個分子都被一個鎖定鏈沉默。在細胞內(nèi)部，目標miRNA與鎖定鏈雜交，并通過鏈置換反應從DNAzyme釋放鎖鏈。解鎖的DNAzyme隨后與其底物雜交。二價金屬輔因子激活裂解底物的DNAzyme，產(chǎn)生兩個DNA片段F1、F2。其中含有FAM的F1片段從AuNP表面釋放，恢復由AuNP先前淬滅的熒光。同時，DNAzyme從F2片段解離，隨后與下一個底物鏈雜交，從而實現(xiàn)了從一個底物鏈到下一個底物鏈的電機行走。通過測量熒光增加，可以實時地對DNA馬達的細胞內(nèi)操作進行成像。另外，熒光增加與細胞中目標miRNA鏈的量成比例，使得能夠原位放大地檢測活細胞中的miRNA。Wu等［19］也基于類似的原理實現(xiàn)了功能核酸納米機器檢測體內(nèi)miRNA。

還有類似雙抗夾心介導的脫氧核酶納米機器，Chen等［20］將脫氧核酶連接上配體L1，AuNP上連接有熒光探針鏈和第二配體L2，當加入靶標物質(zhì)后，靶標物質(zhì)與兩個配體結合將脫氧核酶加載到AuNP軌道上，誘導DNAzyme與其底物之間的雜交。在Mg2+的存在下，DNAzyme被活化以切割底物，從AuNP釋放F。釋放的F可以發(fā)熒光，可以實時監(jiān)控電機的運行情況。

此外，還有將脫氧核酶鎖定在發(fā)卡結構中的納米機器，Yang等［21］構建了此納米機器用于在活細胞中對miRNA進行擴增成像。它由AuNP和發(fā)卡鎖定的脫氧核酶鏈組成。在沒有靶miRNA時，發(fā)夾鎖定的脫氧核酶鏈通過分子內(nèi)雜交形成發(fā)夾結構，這樣就抑制了脫氧核酶鏈的催化活性，并且通過AuNP淬滅熒光。然而，在靶標存在下，靶標—探針雜交可打開發(fā)夾并在催化核心中形成活性二級結構以產(chǎn)生“活性”DNAzyme，然后在Mg2+的輔助下切割自身鏈。切割的兩個較短的DNA片段與目標分離。結果顯示，熒光團從AuNP中釋放出來，并且熒光增強。同時，靶標也被釋放并結合另一個發(fā)夾鎖定的脫氧核酶鏈以驅(qū)動另一個循環(huán)。以這種方式，目標回收擴增導致顯著的信號增強，因此具有較高的檢測靈敏度。

4 霍利迪功能核酸介導的納米機器

2006年，Buranachai等［22］構建了一種節(jié)拍器型功能核酸納米機器，該節(jié)拍器是由4條單鏈DNA組成，形成一個四路連接點（霍利迪連接點）［23］，兩條額外的單鏈突出部分能夠彼此形成堿基對。在存在二價金屬離子時，霍利迪連接處折疊成緊湊的構象——IsoI構象①和IsoII構象③④，分子通過中間開放結構②實現(xiàn)兩個緊湊構象之間的轉變，黏性末端的堿基配對降低了結構④的自由能，迫使納米節(jié)拍器保持更長的IsoII構象。二價金屬離子（如Mg2+）的存在對構象的轉變至關重要，并且這種隨機節(jié)拍器的滴答速率取決于離子濃度。另外，可以通過一組基于DNA的開關（去活化劑/活化劑）來可逆的停止/重新激活黏性末端。去活化劑競爭性地結合到螺旋末端的單鏈突出端上，使黏性末端沉默。這種結合為活化劑結合留下懸突柄，并且隨后通過三股分支遷移移除去活化劑。在這種節(jié)拍器中，單鏈突出部分分別用熒光團和淬滅劑功能化，熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）供體和受體分別連接到兩個螺旋末端，根據(jù)空間距離不同顯示不同頻率的FRET以此表征該納米機器的運轉。

5 基于納米材料的功能核酸納米機器

5.1 基于非金屬納米材料的功能核酸納米機器

5.1.1 基于碳納米材料的功能核酸納米機器 碳納米管是一種具有特殊結構的一維量子材料，有單壁碳納米管（Single-wall carbon nanotubes，SWNTs）和多壁碳納米管（Multi-wall carbon nanotubes，MWNTs），相比較而言MWNTs具有較大的縱橫比［24］，直徑較大［25］。功能核酸與碳納米管主要以兩種方式結合，一是單鏈DNA（ssDNA）通過堿基芳環(huán)與碳納米管側壁之間的π-π電子相互作用吸附到碳納米管上［26］，也可能是通過范德華力、疏水相互作用、靜電作用等綜合的結果［27］，故碳納米管只吸附單鏈，對雙鏈的作用較弱；二是將碳納米管功能化通過靜電相互作用結合。通過篩選寡核苷酸文庫，Zheng等［28-29］已經(jīng)證明，單鏈DNA的特定序列可以自組裝成單個碳納米管周圍的螺旋結構。2009年，Zhao等［30］首先提出了由單壁碳納米管誘導的DNA納米機器，它可以在生理pH下檢測人端粒i-motif DNA的形成。他們將人類端粒G-四聯(lián)體作為DNA馬達固定在金表面上，DNA馬達和其互補的人端粒i-motif DNA之間的可逆雜交可以通過SWNT調(diào)節(jié)而不改變?nèi)芤簆H。多壁碳納米管通過氧化作用，易形成可電離的羧基，羧基在水溶液中帶負電荷，會通過靜電作用吸附帶正電荷的納米金［31］。馮永成等［32］將多壁碳納米管氧化使其表面帶有羧基基團，再通過多步化學反應使羧基轉化為巰基，加入HAuCl4后，在模板上通過甲醛的還原生成金納米粒子，最后在模板的引導下連成金納米線。

除碳納米管外，二維單原子結構的氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）的應用也較廣泛。單鏈DNA可以通過共價鍵結合作用和π-π電子堆積物理吸附在氧化石墨烯表面。此外，氧化石墨烯具有比較高的熒光淬滅效應。Dong等［33］通過將氧化石墨烯距離依賴性熒光淬滅與等溫鏈置換聚合酶反應（Isothermal chain displacement polymerase reaction，ISDPR）相結合來提高檢測miRNA的靈敏度。在缺乏特異性靶標的情況下，ssDNA和GO之間的相互作用較強，以及基于FRET的GO機制的高熒光淬滅效率，使得用熒光染料標記的ssDNA顯示最小的背景熒光。當特定靶標存在時，底物鏈識別靶標形成雙鏈結構，由于DNA-miRNA雙鏈螺旋與GO之間的相互作用較弱，因此觀察到強烈的熒光。

5.1.2 基于硅納米材料的功能核酸納米機器 介孔二氧化硅納米粒子（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）是一種新型的無機納米粒子，在藥物遞送系統(tǒng)被廣泛應用，其優(yōu)勢在于MSNs有較大的比表面積（600-1 000 m2/g）和比孔容（0.6-1.0 cm3/g），允許較高的載藥量；而且具有良好的生物相容性，所以MSNs不僅可以作為將不溶于水的藥物分子整合到細胞中的載體，還可以保護它們不被破壞，可應用于臨床診斷和治療；另外，MSNs表面有豐富的硅羥基，可進行化學修飾使其表面功能化，以滿足不同的生物學需求［34-35］。MSNs 易富集于肝臟和脾臟，是一種有潛力的肝靶向載體。Gu等［36］在MSNs外表面鏈接聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子，然后將D-半乳糖胺分子共價結合到MSNs- PEG上，其中PEG增加了MSNs在體循環(huán)中的停留時間，D-半乳糖胺是靶向肝癌細胞表面脫唾液酸蛋白受體。MSNs內(nèi)表面封裝阿霉素抗癌藥物，負載藥物以pH依賴性方式釋放，在pH5.5和6.5時比在pH 7.4時釋放得更快。

5.2 基于金屬納米材料的功能核酸納米機器

5.2.1 金納米粒子介導的納米機器 AuNPs合成方式簡單，穩(wěn)定性好，抗氧化能力強，能使用合適的配體提供高比表面積，對人體無害［37］，且具有良好的生物相容性，能提供一個類似生物分子本體環(huán)境的微環(huán)境，較好的保持生物組分的活性［38］。金納米粒子大多是用氯金酸和還原劑（通常檸檬酸鈉鹽或硼氫化物）反應制得，納米金顆粒比較容易同巰基結合形成很強的Au-S共價鍵［39］，將帶有各種活性基團的巰基化合物通過共價鍵結合在金納米表面，還可通過靜電吸附作用將氨基非共價結合到金納米上，形成的探針可用于生物體系的檢測。金納米粒子起信號增強和放大的作用，提高了生物傳感器的靈敏度。

AuNPs能夠高效的淬滅染料分子的熒光，所以當帶有熒光基團的探針結合在金納米顆粒上，其熒光被淬滅，無熒光信號輸出，當用酶或其他物質(zhì)切割探針，使得熒光基團從金納米顆粒上釋放，則發(fā)出熒光。AuNPs常與脫氧核酶等一起運用于功能核酸納米機器，下文有詳細闡述。

5.2.2 基于Fe3O4磁納米粒子的納米機器 磁納米粒子（Magnetic nanoparticles，MNPS）具有異常的磁學性質(zhì)：超順磁性、高矯頑力、高磁化率和低居里溫度［40］等特性，其中超順磁性Fe3O4納米粒子由于其具有粒徑小、毒性低、磁響應性強等優(yōu)點，被視為最佳的磁性納米材料［41］，廣泛應用于生物醫(yī)學領域。Bacon等［42］開發(fā)了一種用于細胞凋亡信號的磁性開關，他們在MNPs表面修飾死亡受體4（Death receptor 4，DR4）單克隆抗體，可以特異性結合DLD-1人結直腸腺癌上皮細胞表面的死亡因子。在磁場開關處于On模式時施加磁場，在磁力作用下誘導死亡因子聚集，促進細胞凋亡，并且成功誘導了斑馬魚的細胞凋亡，導致形態(tài)發(fā)生明顯變化。

Fe3O4有其獨特的磁學特性，但由于其比表面積較高，具有強烈的聚集傾向，所以通過表面包覆或分子修飾可降低表面能，調(diào)節(jié)磁納米粒子的生物相容性和反應特性［43］。同時，金具有良好的化學穩(wěn)定性和生物相容性及特殊的光譜性質(zhì)，且易表面修飾，故在Fe3O4表面修飾Au以提高納米顆粒的化學穩(wěn)定性，這種具有金包裹層的核殼結構能減少內(nèi)核的氧化和腐蝕，金殼的等離子體共振性質(zhì)還能用于光熱治療［44-45］。

5.2.3 基于金屬有機骨架的納米機器 金屬-有機骨架（Metal-organic frameworks，MOFs）也稱為配位聚合物或配位網(wǎng)絡，是一類由金屬離子或簇與有機連接基團在相對溫和的條件下自組裝形成的混合材料［46-48］。MOFs屬于一種新興的結晶分子功能材料，具有很多特性，其中包括超高的孔隙率、優(yōu)異的結構可調(diào)性、巨大的內(nèi)部表面積、結構多樣性、高的化學穩(wěn)定性和強大的熱穩(wěn)定性等［47］。MOFs的結構也可以從一維（One-dimensional，1D）、二維（Two-dimensional，2D）到三維（Three-dimensional，3D）［48］。目前，MOFs已被廣泛應用于化工、醫(yī)藥等領域，其中包括均相催化、氣體儲存與分離、作為藥物遞送載體及生物成像等。

Kahn等［49］進一步推進了MOFs與功能核酸相結合的檢測技術的發(fā)展。他們首次將刺激響應性DNA作為加帽單元固定在MOFs的表面來控制MOFs的加載和卸載。他們應用 4，4’，4’’-苯 -1，3，5-三 -苯甲酸（4，4’，4’’-benzene-1，3，5-tri-benzoic acid，BTB）、氨基對苯二甲酸這兩種有機配體和羧酸鋅簇為原料反應生成MOFs，并利用酰胺鍵將單鏈DNA修飾在MOFs表面分別設計了3種pH和K+刺激響應性DNA功能化MOFs。第一種是pH刺激響應性系統(tǒng)，通過將pH在5.5和7.4之間進行切換使富含C堿基的一段DNA序列在C-四鏈體和無規(guī)則卷曲結構之間進行變換來實現(xiàn)MOFs孔中貨物分子的可控釋放。第二種同樣是pH刺激響應性系統(tǒng)，通過調(diào)控pH形成三螺旋DNA來實現(xiàn)MOFs的卸載。第三種則是K+刺激響應性系統(tǒng)，通過控制反應液中K+和螯合劑的濃度使一段富含G堿基的DNA序列在K+依賴性G-四鏈體結構和無規(guī)則卷曲結構之間進行變換來實現(xiàn)MOFs孔中貨物分子的可控釋放。

6 基于鏈置換的功能核酸納米機器

核酸單雙鏈有明顯的不同，單鏈自由度高、柔性強，其構象可以自由轉變，而雙鏈是剛性結構，在溫和的條件下，單鏈DNA 會選擇體系中與其互補性最強的其他單鏈分子組成雙鏈，因此通過控制雙鏈的形成或破壞就可以實現(xiàn)納米機器的驅(qū)動［50］。

第一批核酸納米機器之一——鑷子就是鏈置換反應介導的核酸納米機器。2000年，Yurke等［51］構建了鑷子這一核酸納米機器，該納米機器由3 條DNA 單鏈A、B 和C 組成，其中A鏈含有兩個18堿基序列區(qū)域，分別與B、C鏈的末端通過沃森-克里克氫鍵結合成雙鏈。通過加入單鏈DNA與鑷子特定相互作用來驅(qū)動納米機器的運轉。以在A鏈兩端修飾熒光基團和淬滅基團表征鑷子的“開”“關”狀態(tài)。當加入燃料鏈，其與鑷子的B、C鏈的游離堿基配對結合，使鑷子處于關閉狀態(tài)，當加入與燃料鏈完全互補的反燃料鏈后，通過鏈置換反應與燃料鏈形成穩(wěn)定的雙螺旋結構，從而將燃料鏈從鑷子上移下來，鑷子恢復打開狀態(tài)。2004年，Chen等［52］將脫氧核酶引入了納米鑷子中，DNA馬達由兩條單鏈組成，其中一條鏈含有能切割RNA的10-23DNAzyme，燃料鏈是DNAzyme的底物，當加入燃料鏈后其與DNAzyme鏈結合使得鑷子打開，當有金屬離子存在時，DNAzyme切割底物，鑷子又回到關閉狀態(tài)。

2004年，Shin等［53］構建的DNA步行者（Walker），也是鏈置換反應介導的核酸納米機器，兩條部分互補的核酸鏈作為walker，A1鏈作為連接者將walker錨定在軌道（track）的特定單鏈上，再加入與A1鏈互補的D1鏈通過鏈置換反應產(chǎn)生雙鏈廢料并釋放，然后可加入下一個連接鏈使walker錨定在track的另一個單鏈上，以此往復可實現(xiàn)walker在track上的行走，該納米機器類似于鑷子，以DNA為燃料，以鏈雜合能作為驅(qū)動力。

7 基于點擊反應的功能核酸納米機器

點擊化學是在溫和條件下以簡便、快速、可靠和高效率反應將兩個活性伴侶偶聯(lián)起來的最通用和模塊化的方法之一［54］。點擊化學已成為共價連接分子的最常用和最可靠的方法之一，已經(jīng)運用于納米材料的化學［55］、化學生物學、藥物輸送和藥物化學［56-57］等學科中。點擊化學最大的魅力是可能產(chǎn)生新穎的結構，點擊反應主要有4 種類型：環(huán)加成反應，特別是1，3-偶極環(huán)加成反應，也包括雜環(huán)Diels-Alder反應；親核開環(huán)反應，特別是張力雜環(huán)的親電試劑開環(huán)；非醇醛的羰基化學；碳碳多鍵的加成反應。其中銅（I）催化疊氮化物和末端乙炔形成1，2，3-三唑是一個特別強大的連接反應，因為它具有高度的可靠性，完整的特異性和反應物的生物相容性。三唑產(chǎn)品不僅僅是被動連接器，它們很容易通過氫鍵和偶極相互作用與生物靶標相關聯(lián)。Ge等［58］根據(jù)一價銅離子催化點擊化學反應以及DNAzyme的催化作用，并利用點擊化學反應連接劈裂DNAzyme實現(xiàn)了對銅離子的可視化定量檢測。Ni等［59］通過點擊化學反應，將DNA與聚乳酸（Polylactide，PLA）連接形成DNA-PLA結合物，然后自組裝成兩親性DNA-PLA膠束；接下來，使用綴合的DNA作為啟動子，通過原位滾環(huán)轉錄（Rolling circle transcription，RCT）在DNA-PLA膠束上合成多短發(fā)卡RNA（Poly-short hairpin RNA，polyshRNA），產(chǎn)生聚乳酸@多短發(fā)卡RNA微流（PLA @poly-shRNA microflowers）；最后，使用生物相容性和多功能聚（乙二醇）轉接多肽（Multifunctional poly（Ethylene glycol）-grafted polypeptides，PPT-g-PEG）將微絨毛靜電凝結成納米顆粒。這些PLA @ polyshRNA @ PPT-g-PEG納米粒子被有效地遞送到多藥耐藥蛋白（Multidrug resistance protein，MDR）乳腺癌細胞中，并在異種移植腫瘤中積累，導致MDR1沉默，細胞內(nèi)阿霉素（Doxorubicin，Dox）積累，增強了細胞凋亡和腫瘤治療功效。

8 基于三螺旋核酸的功能核酸納米機器

三螺旋核酸（Triplex nucleic acids，TNAs）是在經(jīng)典的沃森-克里克（Waston-Crick）氫鍵形成的雙鏈核酸基礎上，第三條寡核苷酸鏈以非經(jīng)典的胡斯特（Hoogsteen）氫鍵嵌入到雙鏈大溝中形成的超分子核酸組裝體［60］。

2014年，Amodio等［61］研究出一種pH響應的以鏈置換反應為基礎的TNAs納米機器，在OH-誘導下，以胞嘧啶-鳥嘌呤（Guanine，G）*胞嘧啶-（C-G*C）為主要序列組成的三螺旋結構中的Hoogsteen鍵斷裂形成雙螺旋結構，加入侵入鏈（Invading strand，IS）發(fā)生鏈置換、產(chǎn)生游離的三螺旋第三鏈、進而發(fā)生后續(xù)的鏈置換反應。利用標記在DNA鏈上的熒光供體基團與熒光受體基團表征納米機器的運轉。

2017年，Ranallo等［62］設計了一種模塊化的TNAs納米機器。該納米機器由特異性抗體驅(qū)動，利用胸腺嘧啶-腺嘌呤（Adenine，A）*胸腺嘧啶-（T-A*T）、C-G*C的三鏈核酸堿基互補配對規(guī)則，使用夾鉗狀結構的黑色核酸鏈特異性識別藍色核酸鏈（DNA Cargo），形成三鏈核酸納米機器，并且在夾鉗狀核酸鏈的兩側末端共價偶聯(lián)一對抗體。當抗體特異性與納米機器上的抗原結合，會驅(qū)動三鏈核酸納米機器的構象變化，先打開亞穩(wěn)態(tài)的Hoogsteen氫鍵、再打開不穩(wěn)定的Watson-Crick氫鍵，進而釋放DNA Cargo。他們在DNA Cargo兩側分別標記熒光基團和淬滅基團，通過熒光強度的差異表征抗體驅(qū)動的三鏈核酸納米機器的構象變化。該納米機器能夠快速、通用、可逆及快速的攜帶并釋放以單鏈核酸為模型的分子貨物，在藥物遞送與釋放，現(xiàn)場快速檢測和細胞內(nèi)成像等應用領域具有巨大的應用潛力。

9 基于pH響應的功能核酸納米機器

核酸四鏈體結構除上文中提到的G-四鏈體，還有C-四鏈體（i-motif），它是由富C核酸序列中的兩個胞嘧啶C通過結合一個質(zhì)子形成3個氫鍵作為一層而交叉堆疊起來的［63-64］。i-motif的四螺旋結構只有在弱酸性條件下能維持，在中性或堿性條件下四螺旋結構會解開形成單鏈。Liu等［65］利用i-motif響應pH的性質(zhì)設計了一種納米機器，該納米機器就是一段富C序列，通過在該鏈兩端標記熒光基團和淬滅基團來表征該納米機器的運作狀態(tài)。在弱酸性（pH ＜6.3）條件下該單鏈DNA折疊成i-motif 結構，鏈的兩端相互靠近，熒光淬滅，此時納米機器呈關閉狀態(tài)。當向溶液中加入堿使溶液pH達到8.0左右，i-motif 結構不能維持，解開呈單鏈結構，鏈兩端遠離，熒光恢復，納米機器呈打開狀態(tài)。該過程是可逆的，再加入酸，又可形成i-motif 結構，如此循環(huán)往復，通過不斷加入酸堿促使納米機器的運轉。

Mao等［66］設計出利用pH誘導包裹釋放小分子的納米機器。富C的單鏈DNA修飾在金納米表面上形成單層膜，此時填充密度較低，允許小分子自由擴散，當加入酸使pH4.5時，形成i-motif四螺旋結構，由于四鏈DNA空間位阻大于單鏈，此時該膜不允許小分子滲透，實現(xiàn)小分子的包裹，當再加入堿使pH4.5時i-motif結構被轉化為單鏈，小分子得以釋放。

10 基于光誘導的功能核酸納米機器

大多數(shù)納米機器需要分子燃料驅(qū)動，典型的是需要互補的DNA鏈作為燃料通過鏈置換反應來驅(qū)動，這樣會產(chǎn)生廢棄的DNA雙鏈，在機器重復操作時溶液中廢棄的雙鏈持續(xù)堆積必定會影響機器運作效率。另外，還面臨著“環(huán)境問題”，所以使用清潔能源來驅(qū)動已經(jīng)成為必然，而光就是其中之一，一些光響應分子（如螺吡喃、二芳基乙烯、芪和偶氮苯等）可通過幾何形狀的變化將光能轉化為機械能。

Liu等［67］研究了光驅(qū)動i-motif DNA馬達運轉。他們將含有DNA X，孔雀石綠甲醇堿（Malachite green carbinol base，MGCB）和十六烷基三甲基溴化銨（Cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）的初始溶液配制成微酸性，這有助于DNA X形成i-motif結構，在302 nm紫外光的存在下，MGCB釋放出氫氧根離子（OH-）導致pH值的增加，以及顯示出明顯的顏色變化，所以i-motif結構將變形為去質(zhì)子化的無規(guī)則卷曲結構。光線關閉后，孔雀石綠（Malachite green，MG）陽離子會與OH-結合成MGCB進行循環(huán)，溶液pH值相應降低，并且DNA X再次切換回i-motif構象。因此，可以通過交替打開和關閉紫外線來循環(huán)DNA X的構象轉換。2008年，Liang等［68］報道了一種利用光誘導來控制納米機器的開關，他們改進了控制納米鑷子開關的燃料鏈，在燃料鏈的堿基之間修飾一定數(shù)量的偶氮苯，偶氮苯是一種光敏基團，在可見光下呈反式構象，在紫外光下呈順式構象，通過切換不同的光使構象改變，導致堿基發(fā)生扭轉，氫鍵被破壞，燃料鏈從鑷子上脫離。所以使用紫外光照射（λ= 330-350 nm）將鑷子光開關切換至開路狀態(tài)，并且在可見光（λ= 440-460 nm）下將光鑷切換至閉合狀態(tài)。這種控制是非接觸的，且不需要添加另外的寡核苷酸作為燃料。

11 功能核酸納米機器藥物靶向遞送

Sun等［69］開發(fā)了一種生物感應的繭狀抗癌藥物輸送系統(tǒng)，由嵌入了酸敏脫氧核糖核酸酶I（DNAase I）納米膠囊（Nanocapsule，NCa）的脫氧核酶可降解DNA納米纖維（Nanoclew，NCl）組成，用于靶向癌癥治療（圖3-A）。NCl由通過滾環(huán)擴增（Rolling circle amplification，RCA）合成的長鏈單鏈DNA組裝而成。將多個GC配對序列整合到NCl中以增強抗癌藥物多柔比星（Doxorubicin，DOX）的負載能力。同時，帶負電的DNAase I被包封在帶正電荷的酸可降解聚合物納米凝膠中，以便通過靜電相互作用將DNase I修飾到NCl中。在酸性環(huán)境中，DNase I的活性通過NCa的聚合物殼的酸觸發(fā)脫落而活化，導致NCl的繭樣自我降解并促進DOX的釋放以增強治療功效。

Mou等［70］構建了一種自組裝含氟尿苷的DNA多面體用于藥物靶向遞送以治療癌癥（圖 3-A）。氟尿苷（Fluorouridine，F(xiàn)）是一種核苷類似物治療劑，它的結構和天然的胸腺嘧啶（Thymine，T）脫氧核糖核苷的結構非常相似，所以通過常規(guī)固相合成將F整合到DNA鏈中，然后將這些鏈組裝成DNA四面體、十二面體和巴基球，具有確定的載藥比以及可調(diào)的大小和形態(tài)。作為一種新型的藥物輸送系統(tǒng)，這些含有藥物的DNA多面體可以理想地模擬特洛伊木馬，將化療藥物輸送到腫瘤細胞中并與癌癥作斗爭。體外和體內(nèi)結果表明，具有巴基球結構的DNA特洛伊木馬具有優(yōu)于游離藥物和其他制劑的抗癌能力。通過精確控制納米載體的載藥量和結構，DNA特洛伊木馬可能在抗癌治療中發(fā)揮重要作用，并在納米醫(yī)學領域表現(xiàn)出巨大的潛力。

圖3 功能核酸納米機器在藥物靶向遞送和生物成像上的應用圖

2006年，Rothemund等［71］將長鏈單鏈DNA分子折疊成“笑臉”、“五角星”等復雜的二維形狀（圖3-C），該研究創(chuàng)建了“DNA折紙術”，為后續(xù)在其上修飾更多功能基團，實現(xiàn)在生物醫(yī)藥領域的廣泛應用奠定了基礎。2018年，Li等［72］利用DNA折紙術構建出一種DNA納米機器人，可靶向運輸凝血酶到腫瘤細胞處，從而能夠阻塞腫瘤處血管，阻礙對于腫瘤的營養(yǎng)和氧氣的供應，從而誘導腫瘤細胞死亡（圖3-D）。他們首先構建出一種DNA自組裝的長方形折紙片，然后將凝血酶固定到折紙片表面，再在折紙片兩端連接核仁素適配體使得長方形折紙片能夠自動折疊為管狀，從而形成了內(nèi)部攜帶有凝血酶的DNA納米機器人。當該機器人被運送至腫瘤細胞處接觸到腫瘤細胞特異性表達的核仁素時便會再次自動打開，釋放凝血酶，在凝血酶的作用下促使腫瘤細胞處血管堵塞從而殺死腫瘤細胞。較高或相當?shù)馁|(zhì)粒DNA在COS-7細胞和HepG2細胞中的基因表達。CD-PEI內(nèi)化到細胞中，在不同的激發(fā)波長下顯示出可調(diào)諧的熒光發(fā)射，表明CD-PEI在基因遞送和生物成像中的潛在應用。

12 功能核酸納米機器生物成像

Yuan等［73］報道了一種針對生物成像和光動力療法的特定適體引導的G-四鏈體DNA納米機器，并且它能夠?qū)Π┘毎M行選擇性識別和成像，可控制和有效地激活光敏劑，改善治療效果（圖3-E）。他們將富含鳥嘌呤的DNA片段與適體連接形成雙功能DNA序列，稱為G4適體。G4適體不僅加載光敏劑，而且特異性識別目標細胞。將G4適體與上轉換納米顆粒（Upconversion nanoparticles，UCNP）生物偶聯(lián)，因此將光敏劑5，10，15，20-四-（1-甲基-4-吡啶基）-21H，23H-卟吩（5，10，15，20-tetrakis-（1-methyl-4-pyridyl）-21H，23H-porphine，TMPyP4）置于UCNP附近的位置，用于UCNP和TMPyP4之間的能量轉移。當納米機器被遞送到癌細胞中，UCNP就被近紅外光（Near-infrared light，NIR）激發(fā)，發(fā)射可見光以使癌細胞成像，并且反過來激活TMPyP4，使得最終產(chǎn)生足夠的活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）以有效地殺死癌細胞。

Liu等［74］將基于聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine，PEI）鈍化增強熒光的碳點納米載體用于生物成像，他們采用一步微波輔助熱解甘油和支化PEI25k混合物制備了PEI官能化碳點（CD-PEI），其中碳納米粒子的形成和表面鈍化同時完成（圖3-F）。在這個混合的C點中，PEI分子在該系統(tǒng)中起到兩個關鍵作用——作為富含氮的化合物來鈍化表面以增強熒光，并作為聚電解質(zhì)來濃縮DNA。該CD-PEI被證明是水溶性的并且依靠激發(fā)波長發(fā)出穩(wěn)定的明亮的多色熒光。CD-PEI的DNA縮合能力和細胞毒性可以通過熱解時間來調(diào)節(jié)，可能是由于在形成碳點期間PEI的某種程度的破壞。相對于對照PEI25k，在合適的熱解時間獲得的CD-PEI表現(xiàn)出較低的毒性，

13 總結與展望

目前基于G-四鏈體功能核酸介導的、適配子功能核酸介導的、脫氧核酶介導的、霍利迪結功能核酸介導的、基于非金屬、金屬材料的、鏈置換的、點擊反應的、三螺旋核酸的、pH響應的及光誘導的功能核酸納米機器有很多，但是這些納米機器存在很多不足，如鏈置換反應產(chǎn)生廢棄的雙鏈，影響機器的效率和壽命；脫氧核酶介導的需要體外進行金屬離子的補充，所需操作時間過長，不適合在實際應用中；pH響應的需要不斷加入酸堿，產(chǎn)生的鹽經(jīng)多次循環(huán)也會影響機器效率；遇到活性生物大分子時缺少程序性的響應模塊，無法進行類似于基因回路機制的胞內(nèi)調(diào)控，并且DNA納米元件在胞內(nèi)動態(tài)環(huán)境下進行組裝、折疊效率較低，擴散效率以及雜交率與體外環(huán)境相比也大大降低。

功能核酸納米機器處于剛剛起步階段，隨著科技的進步與發(fā)展功能核酸納米機器將會有更廣闊的應用前景，其未來發(fā)展趨勢：（1）復合型生物納米機器的開發(fā)，功能核酸納米機器與其他生物納米機器的功能組件的聯(lián)合使用，以期達到更高效的、友好的、簡潔的效果。（2）胞內(nèi)、體內(nèi)驅(qū)動可控納米機器的開發(fā)，一是克服體內(nèi)復雜環(huán)境，二是由細胞內(nèi)物質(zhì)提供驅(qū)動力［75］，實現(xiàn)納米機器智能化控制，實時監(jiān)測控制生物反應進程。（3）一體化、多元化功能核酸納米機器的開發(fā)，一體化設計以解決不同反應組件散落于細胞內(nèi)由于時空差異而造成運行效率低的問題［76］，多元化驅(qū)動可使功能核酸納米機器同時發(fā)揮多重作用，豐富功能核酸納米機器的運動模式；更高效持久的執(zhí)行復雜生物任務。（4）搭載功能核酸的非核酸納米材料的納米毒性風險評估，安全無毒副作用的劑量是我們開展體內(nèi)實驗的前提，將重點評估靶向納米材料在體內(nèi)局部組織及器官的高濃度富集所帶來的風險，復合納米材料的體內(nèi)協(xié)同毒性，以及緩釋納米材料的慢性毒性。