李倩，高潔凡，齊冰麗

(滄州市中心醫(yī)院，河北滄州061000)

卵巢癌是女性惡性腫瘤中預(yù)后最差的一種，因缺乏高效的篩查方法，確診時多處于進(jìn)展期[1，2]。隨著近年來腹腔鏡手術(shù)的發(fā)展成熟，以及吉西他濱等二線化療藥物的研發(fā)上市，給卵巢癌患者帶來了更多希望，但并未有效延長其總生存期，這主要與患者對鉑類基礎(chǔ)化療藥物的耐藥有關(guān)[3～5]。結(jié)腸癌相關(guān)基因KPNA2是近年來發(fā)現(xiàn)的與結(jié)腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的標(biāo)志物[6，7]。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)KPNA2在肝癌、肺炎、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中均可檢出[8～10]，但目前尚無KPNA2與卵巢癌鉑類耐藥相關(guān)的研究報道。2016年3月1日～2018年5月3日，我們觀察了沉默KPNA2對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和順鉑敏感性的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑 人卵巢癌細(xì)胞系CAOV3購于上海匹拓生物科技有限公司。Erk通路抑制劑U0126d、靶向KPNA2基因的pSUPER-Egfp-s3重組質(zhì)粒以及空質(zhì)粒pSUPER-Egfp-neo購于上海北諾生物科技有限公司；兔抗人KPNA2單克隆抗體、兔抗人Erk1/2和p-Erk1/2多克隆抗體、兔抗人Caspase-3、活化后Caspase-3單克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ECL顯色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Transwell小室購于北京科宇深藍(lán)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 CAOV3細(xì)胞放入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期CAOV3細(xì)胞，按1×106/mL密度接種于24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞60%～80%融合后，分為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(pSUPER-Egfp-s3轉(zhuǎn)染CAOV3細(xì)胞)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(pSUPER-Egfp-neo轉(zhuǎn)染CAOV3細(xì)胞)、空白對照組(未轉(zhuǎn)染)、U0126d組(CAOV3細(xì)胞+30 μmol/L 的U0126d)、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組(pSUPER-Egfp-s3轉(zhuǎn)染CAOV3細(xì)胞+30 μmol/L的U0126d)。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗，G418篩選細(xì)胞克隆集落。

1.2.2 各組CAOV3細(xì)胞KPNA2 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR。收集轉(zhuǎn)染48 h后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照組CAOV3細(xì)胞，TRIzol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。KPNA2基因上游引物5′-GGAAGCACCATTACGAAGG-3′，下游引物5′-TCCCGAAGGTAACATAACTA-3′，引物合成由南京信帆生物技術(shù)有限公司合成。實時熒光定量PCR常規(guī)反應(yīng)條件下共進(jìn)行40個循環(huán)，94 ℃延伸4 min，以GAPDH為內(nèi)參，計算KPNA2 mRNA的表達(dá)量(用2-△△Ct表示)。

1.2.3 各組CAOV3細(xì)胞培養(yǎng)液KPNA2、Erk1/2、p-Erk1/2、Caspase-3、活化后Caspase-3蛋白檢測 采用Western blotting。分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照組、U0126d組及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組的CAOV3細(xì)胞均勻接種到6孔板，培養(yǎng)至40%～50%融合后，用蛋白測定試劑盒檢測培養(yǎng)液上清中的受檢蛋白，以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果用灰度值表示。

1.2.4 各組CAOV3細(xì)胞生長抑制及順鉑敏感性觀察 采用MTT法。 取對數(shù)期重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照組、U0126d組及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組的CAOV3細(xì)胞細(xì)胞，胰酶消化后配置單細(xì)胞懸液，按1×106/孔密度接種到96孔板，CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為0、5、10、20、40、80 μmol/L的順鉑，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)2 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后每孔滴加10 g/L的MTT 10 μL，培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加100 μL二甲基亞砜，振蕩5 min，讀取酶標(biāo)儀450 nm波長處的吸光度值，計算CAOV3細(xì)胞生長抑制率及順鉑對CAOV3細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.5 加入順鉑后各組CAOV3細(xì)胞凋亡觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。將對數(shù)期重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照組、U0126d組及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組的CAOV3細(xì)胞各分為兩份：一份按1×106/孔的密度接種到6孔板，細(xì)胞貼壁后加入順鉑溶液(濃度為“1.2.4”中空白對照組的IC50濃度)；另一份不加順鉑。常規(guī)培養(yǎng)24 h，取上層懸浮細(xì)胞，用PBS溶液配成1×105/孔的單細(xì)胞懸液，取 5 mL放入流式管中，滴加FITC和PI，避光放置30 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞。

1.2.6 各組CAOV3細(xì)胞遷移能力觀察 采用Transwell法。取對數(shù)期重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照組、U0126d組及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組的CAOV3細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105/mL，向Transwell上室中滴加300 μL細(xì)胞液，下室中滴加600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出小室，固定、染色、封固。在膜的中間和周邊分別隨機(jī)選取3個視野，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)遷移細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照組CAOV3細(xì)胞KPNA2 mRNA、蛋白表達(dá)量比較 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照組CAOV3細(xì)胞的KPNA2 mRNA相對表達(dá)量分別為0.09±0.01、0.49±0.03、0.52±0.06，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組相比，P均<0.01。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照組CAOV3細(xì)胞的KPNA2蛋白相對表達(dá)量分別為0.18±0.03、0.44±0.05、0.45±0.05，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組相比，P均<0.01。

2.2 各組細(xì)胞Erk1/2、p-Erk1/2、Caspase-3、活化后Caspase-3蛋白表達(dá)比較 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，Erk1/2蛋白表達(dá)量無明顯差異(P均>0.05)，p-Erk1/2、Caspase-3蛋白表達(dá)量降低(P均<0.05)，活化后Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)；與空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組的p-Erk1/2、Caspase-3、活化后Caspase-3蛋白表達(dá)改變更為明顯(P均<0.01)；詳見表1。

表1 各組CAOV3細(xì)胞Erk1/2、p-Erk1/2、Caspase-3、活化后Caspase-3蛋白灰度值比較

2.3 各組CAOV3細(xì)胞生長抑制及順鉑敏感性比較 加入5、10、20、40、80 μmol/L順鉑后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組CAOV3細(xì)胞生長抑制率分別為0.23%±0.05%、0.42%±0.08%、0.50%±0.06%、0.61%±0.10%、0.70%±0.13%，空白對照組分別為0.12%±0.02%、0.25%±0.06%、0.33%±0.04%、0.36%±0.08%、0.45%±0.06%，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別為0.15%±0.07%、0.28%±0.05%、0.35%±0.11%、0.42%±0.11%、0.49%±0.08%，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.01。順鉑對空白對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、U0126d組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組CAOV3細(xì)胞的IC50值分別為(46.41±0.52)、(46.19±0.56)、(27.12±0.86)、(38.85±0.91)、(19.95±0.73)μmol/L；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組順鉑的IC50與空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.01;重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組順鉑的IC50與重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，P<0.01。

2.4 加入及未加順鉑的各組CAOV3細(xì)胞凋亡率比較 未加順鉑時，空白對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、U0126d組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組CAOV3細(xì)胞凋亡率分別為0.51%±0.27%、0.77%±0.25%、1.43%±0.12%、2.94%±0.37%、3.85%±0.56%，組間相比，P<0.01。加入順鉑后，空白對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、U0126d組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組CAOV3細(xì)胞凋亡率分別為17.73%±2.35%、19.64%±2.51%、37.61%±1.84%、39.73%±2.38%、49.68%±1.50%；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、U0126d組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組相比，P均<0.05；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組與重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05。

2.5 各組CAOV3細(xì)胞遷移能力比較 空白對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、 U0126d組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組穿過濾膜孔細(xì)胞數(shù)分別為(59.87±5.26)、(63.19±5.57)、(28.57±4.83)、(37.86±4.07)、(25.98±4.53)個;重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、U0126d組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組穿過濾膜孔細(xì)胞數(shù)與空白對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.05。

3 討論

近年來以鉑類化合物為基礎(chǔ)的化療在卵巢癌的臨床治療中取得了一定成效，然而腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致化療失敗，患者5年生存率低至30%[11，12]。本研究的結(jié)果顯示，沉默KPNA2基因后，順鉑對CAOV3細(xì)胞的抑制率明顯上升、IC50值明顯降低、細(xì)胞凋亡率明顯增加、細(xì)胞遷移率明顯降低。以上結(jié)果說明沉默KPNA2基因能夠提高CAOV3細(xì)胞對順鉑化療的敏感性，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。

Erk屬于Mark家族，可通過磷酸化激活多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為[13]。研究[14]顯示結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染KPNA2后，HGF介導(dǎo)的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移可被Erk通路抑制劑U0126d抑制，提示KPNA2高表達(dá)可激活Erk信號通路。沉默胰腺癌細(xì)胞中KPNA2基因表達(dá)后，觀察到胰腺癌細(xì)胞活性明顯降低，對鹽酸吉西他濱的化療敏感性增加，且Erk通路明顯抑制，其下游Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平降低[15]。以上結(jié)果提示Erk通路及其下游信號因子可調(diào)控KPNA2對卵巢癌細(xì)胞功能和順鉑敏感性的影響。本研究的結(jié)果顯示，沉默KPNA2基因后，p-Erk1/2蛋白表達(dá)明顯降低，其下游Caspase-3蛋白表達(dá)也明顯降低，說明沉默KPNA2基因可有效抑制Erk信號通路活性。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，U0126d組p-Erk1/2和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，順鉑對CAOV3細(xì)胞的IC50值明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯增加，細(xì)胞遷移率明顯降低；而重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+U0126d組上述改變更加顯著。說明抑制Erk信號通路獲得的效果與沉默KPNA2基因相似，而且二者聯(lián)合時可進(jìn)一步增加作用。提示KPNA2可通過Erk信號通路及其下游因子調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡以及對順鉑化療的敏感性。

綜上所述，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因KPNA2沉默后卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲力發(fā)生變化，對順鉑的敏感性增強(qiáng)。KPNA2可能通過Erk信號通路及其下游因子調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和順鉑敏感性。