陳小平，任新萍，杜依蓓，薛金玲

(鹽城市第一人民醫(yī)院，江蘇鹽城224000)

卵巢癌是死亡率最高、預(yù)后最差的女性惡性腫瘤[1]。早期卵巢癌的臨床表現(xiàn)不明顯，缺乏特異、靈敏的早期診斷指標，導致大多數(shù)患者確診時已處于Ⅲ期或Ⅳ期，患者5年總生存率低，預(yù)后差[2]。尋找新的卵巢癌治療靶標、提高治療效率是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點之一。微小RNA(即miRNA)是約22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，可通過與信使RNA(即mRNA)互補結(jié)合，負向調(diào)控靶基因表達。在腫瘤組織和細胞中，表達增加的miRNA分子具有促癌基因功能，相反，表達降低的miRNA分子具有抑癌基因功能[3]，在不同腫瘤組織中，miRNA分子可兼具促癌基因和抑癌基因的功能。miRNA具有作為腫瘤治療靶點的潛能。miRNA-378在多種惡性腫瘤中異常表達，如miRNA-378可抑制結(jié)腸癌細胞增殖和侵襲遷移[4]、抑制胃癌細胞增殖[5]等，Xu等[6]發(fā)現(xiàn)miRNA-378參與卵巢雌二醇生成[6]，而關(guān)于其在卵巢癌中的功能和作用機制的相關(guān)研究甚少。我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-378通過降低c-Myc表達而抑制卵巢癌細胞增殖。2016年9月15日～2017年11月15日，我們觀察了miRNA-378轉(zhuǎn)染對卵巢癌細胞株SKOV3增殖的影響，并初步探討其作用機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、miRNA-378過表達質(zhì)粒、試劑與儀器 人卵巢癌細胞株SKOV3、人源胚胎腎細胞HEK-293T細胞(包被慢病毒的工具細胞)購自美國ATCC公司。慢病毒包裝系統(tǒng)購自北京合生基因科技有限公司，miRNA-378過表達質(zhì)粒、空白載體質(zhì)粒購自山東維真生物科技有限公司。PMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，嘌呤霉素購自美國Sigma公司，TRIzol溶劑購自美國Invitrogen公司，Real-time PCR引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，RIPA裂解液、蛋白上樣緩沖液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，BCA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，環(huán)指蛋白31(RNF31)抗體(ab46322)購自美國Abcam公司，GAPDH抗體、鼠抗兔二抗均購自杭州開泰生物技術(shù)有限公司，ECL化學發(fā)光液購自上海圣爾生物科技有限公司，CCK-8溶液購自上海翊圣生物科技有限公司，結(jié)晶紫溶液購自上海銘博生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)箱購自上海一恒科學儀器有限公司，分光光度計購自美國Thermo公司，化學發(fā)光儀購自美國Bio-Rad公司，酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 SKOV3細胞miRNA-378過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 SKOV3細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，HEK-293T細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，置CO2體積分數(shù)5%、溫度37 ℃的飽和濕度培養(yǎng)箱中。采用慢病毒包裝系統(tǒng)將miRNA-378過表達質(zhì)粒、空白載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期的HEK-293T細胞，6 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，48 h后收集上清液，2 000 r/min、常溫離心5 min，上清液過濾后，收集miRNA-378過表達質(zhì)粒與空白載體質(zhì)粒的病毒懸液。RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)分別與miRNA-378過表達質(zhì)粒與空白載體質(zhì)粒的病毒懸液按照1∶1比例混合。培養(yǎng)SKOV3細胞，采用嘌呤霉素(1 μg/mL)進行miRNA-378穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建。miRNA-378過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SKOV3細胞作為實驗組，空白載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SKOV3細胞作為陰性對照組，SKOV3細胞作為空白對照組。

1.3 各組SKOV3細胞miRNA-378和RNF31 mRNA檢測 采用Real-time PCR技術(shù)。取對數(shù)生長期的實驗組、陰性對照組、空白對照組SKOV3細胞，分別加入1 mL 的TRIzol溶液，提取細胞總RNA，分光光度計檢測RNA濃度和純度。取500 ng 的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物cDNA進行Real-time PCR。miRNA-378正向引物(5′-3′)為CTCCTGACTCCAGGTCCTGT、反向引物(5′-3′)為GCCTTCTGACTCCAAGTCCA，RNF31正向引物(5′-3′)為ACCCCCTATTGAGAGAGATTGCT、反向引物(5′-3′)為TGGAGCCTGGGACAGAGG，18S rRNA正向引物(5′-3′)為GGGAGCCTGAGAAAC、反向引物(5′-3′)為GGGTCGGGAGTGGGT，β-actin正向引物(5′-3′)為CCTGGCACCCAGCACAAT、反向引物(5′-3′)為GCTGATCCACATCTGCTGGAA。以18S rRNA為內(nèi)參計算miRNA-378相對表達量(2-ΔΔCt)，以β-actin為內(nèi)參計算RNF31相對表達量(2-ΔΔCt)，3次獨立實驗后取平均值。

1.4 各組SKOV3細胞 RNF31蛋白檢測 采用Western blotting。取對數(shù)生長期的實驗組、陰性對照組、空白對照組SKOV3細胞，分別加入200 μL的RIPA裂解液，提取細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液混合后沸水煮沸5 min，10% SDS-PAGE膠分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉(PBST配制)封閉；孵育RNF31蛋白一抗工作液，室溫2 h后，PBST洗滌；孵育鼠抗兔HRP標記的二抗工作液，室溫1 h后，PBST洗滌；ECL化學發(fā)光液進行顯色反應(yīng)，觀察并記錄蛋白條帶，計算各蛋白條帶的灰度值，RNF31蛋白相對表達量=RNF31蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值，3次獨立實驗后取平均值。

1.5 各組SKOV3細胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。取對數(shù)生長期的實驗組、陰性對照組、空白對照組SKOV3細胞，分別接種于96孔板中(5 000/孔)，每組設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)過夜后，分別于0、24、48、72 h時每孔加入10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，酶標儀450 nm處測定光密度值(OD值，以此表示細胞增殖能力)，3次獨立實驗后取平均值。

1.6 各組SKOV3細胞克隆形成能力檢測 采用細胞克隆實驗。取對數(shù)生長期的實驗組、陰性對照組、空白對照組SKOV3細胞，分別接種于6孔板中(5 000/孔)，每組設(shè)置4個復(fù)孔，每3～4 d換液，培養(yǎng)14 d，PBS緩沖液洗滌后，10%甲醛溶液固定細胞，0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，PBS緩沖液洗滌后對細胞克隆進行計數(shù)，3次獨立實驗后，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組SKOV3細胞miRNA-378、RNF31 mRNA和RNF31蛋白相對表達量比較 實驗組SKOV3細胞miRNA-378相對表達量高于空白對照組和陰性對照組，實驗組SKOV3細胞RNF31 mRNA和蛋白相對表達量低于空白對照組和陰性對照組，結(jié)果詳見表1。

表1 各組細胞中miRNA-378、RNF31 mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與空白對照組相比，*P<0.05；與陰性對照組相比，#P<0.05。

2.2 各組SKOV3細胞OD值比較 0、24 h時，實驗組、陰性對照組、空白對照組SKOV3細胞OD值相近；48、72 h時，實驗組OD值低于空白對照組和陰性對照組；結(jié)果詳見表2。

表2 各時間點各組細胞OD值比較

注：與空白對照組相比，*P<0.05；與陰性對照組相比，#P<0.05。

2.3 各組SKOV3細胞克隆形成能力比較 實驗組細胞克隆數(shù)目為(19.35±3.15)個，陰性對照組為(78.26±11.35)個，空白對照組為(80.45±10.75)個，見圖1；實驗組與陰性對照組和空白對照組相比，P均<0.01。

圖1 各組細胞SKOV3克隆形成結(jié)果

3 討論

miRNA參與調(diào)控大約30%蛋白編碼基因的表達。在卵巢癌中已鑒定出多種異常表達的miRNA分子，如miRNA-494[7]、miRNA-488[8]和miRNA-152[9]等，其在細胞凋亡、增殖和侵襲遷移過程中均發(fā)揮作用。miRNA-378參與多種疾病(包括腫瘤)的形成和惡性進展過程，如miRNA-378能夠抑制腸黏膜細胞凋亡，保護腸缺血再灌注損傷[10]；膠質(zhì)母細胞瘤中miRNA-378表達降低，外源性增加miRNA-378，可增強膠質(zhì)母細胞瘤細胞對姜黃素的敏感性[11]。

miRNA-378在不同來源的惡性腫瘤中，既能發(fā)揮促癌基因功能又能發(fā)揮抑癌基因功能，如Tan等[12]發(fā)現(xiàn)，miRNA-378在宮頸癌組織表達增加，且可通過直接靶向調(diào)控ATG12基因表達而促進癌細胞侵襲遷移；Li等[13]證實miRNA-378通過調(diào)節(jié)ST7L/Wnt/β-catenin信號通路在宮頸癌形成和惡性進展過程中發(fā)揮促癌基因功能。在結(jié)直腸癌組織中，miRNA-378表達降低，且可作為患者不良預(yù)后的預(yù)測分子[14]；Fei等[15]發(fā)現(xiàn)miRNA-378在胃癌組織中表達降低，并且具有抑制胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移以及促進胃癌細胞凋亡的作用，提示miRNA-378在結(jié)腸癌、胃癌中發(fā)揮抑癌基因功能。而關(guān)于miRNA-378在卵巢癌中的作用，目前仍存在較大爭議，如Chan等[16]發(fā)現(xiàn)miRNA-378在宮頸癌組織和細胞中表達增加，具有促癌基因功能，且miRNA-378可以作為宮頸癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測指標。本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法，增加卵巢癌SKOV3細胞中miRNA-378表達后，細胞增殖能力以及細胞克隆形成能力被明顯抑制，提示miRNA-378發(fā)揮抑制卵巢癌細胞增殖的作用，miRNA-378可能發(fā)揮抑癌基因的功能。我們推測miRNA-378可靶向調(diào)節(jié)多個不同功能的基因，根據(jù)其下游靶基因的功能不同，miRNA-378可在細胞增殖、凋亡等生理過程中發(fā)揮截然不同的功能。

本研究結(jié)果顯示，miRNA-378能夠抑制卵巢癌SKOV3細胞RNF31 mRNA和蛋白表達，提示RNF31可能是miRNA-378下游靶基因，miRNA-378可能在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RNF31基因表達。RNF31基因定位于染色體14q11.2，編碼由1072個氨基酸殘基組成的分子量為118 kD的蛋白質(zhì)，RNF31蛋白屬于RBR蛋白家族，是一種E3泛素連接酶[17]。在正常組織中，RNF31表達水平較低，而在腫瘤組織中RNF31水平升高[18]，提示RNF31可能參與腫瘤形成和惡性進展過程，如Zhu等[19]發(fā)現(xiàn)RNF31能夠維持雌激素受體α(ERα)穩(wěn)定，參與調(diào)節(jié)乳腺癌細胞增殖。根據(jù)本研究結(jié)果推測，miRNA-378可能通過下調(diào)RNF31基因表達，抑制卵巢癌細胞增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，增加卵巢癌細胞中miRNA-378表達，可抑制RNF31基因表達，抑制細胞增殖及細胞克隆形成能力。提示miRNA-378可能通過抑制RNF31表達，進而抑制卵巢癌細胞增殖。后續(xù)研究將探究miRNA-378調(diào)控RNF31表達的內(nèi)在機制。