胡亞坤，胡冠宇， 閆洪超，劉永利，李欣

(1徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇徐州221002；2上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院；3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；4徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市第一人民醫(yī)院；5徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市婦幼保健院)

卵巢癌發(fā)病部位隱匿、發(fā)病機制復(fù)雜，臨床上缺乏早期診斷的方法并且治療效果不佳[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，可獲得早期篩查的指標和生物治療靶點。WWOX蛋白是含WW結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶，WWOX基因是Bednarek等[2]應(yīng)用鳥槍基因測序技術(shù)分離并鑒定得出的一個潛在的抑癌基因。WWOX表達缺失與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān) ，其中包括卵巢癌[3]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個主要步驟，代表了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[4]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail家族在EMT過程中發(fā)揮重要作用[5]。Elf5是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族中具有上皮特異性的一個成員，調(diào)控細胞的增殖與腫瘤的發(fā)生[6,7]。本研究觀察了上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織中WWOX蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Elf5 和Snail1、EMT標志分子的表達變化及其表達的相關(guān)性，分析其表達與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010～2013年在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市第一人民醫(yī)院及徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市婦幼保健院接受手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者300例[排除標準：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、來自于生殖系統(tǒng)其他器官腫瘤的轉(zhuǎn)移癌(包括原發(fā)性雙癌)及首次治療為化療、放療或內(nèi)分泌等其他抗腫瘤治療者]，年齡17～74歲(≥53歲146例,<53歲154例)。300例患者手術(shù)治療時均留取卵巢癌組織及其癌組織相對應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以外的正常組織，經(jīng)病理檢查證實)，石蠟包埋。300例患者具備完整的臨床、病理及隨訪資料(隨訪至患者死亡或至2018年1月，隨訪時間為6～96個月)。FIGO分期：早期(Ⅰ期+Ⅱ期)143例，晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)157例；分化程度：高分化+中分化(G1+G2)124例，低分化(G3)176例；病理類型：漿液性卵巢癌168例，黏液性卵巢癌63例，子宮內(nèi)膜樣癌54例，透明細胞癌15例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移186例，無轉(zhuǎn)移114例。本研究經(jīng)過各醫(yī)院倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意。

1.2 試劑 兔抗人WWOX多克隆抗體、兔抗人Snail1多克隆抗體、兔抗人E-cadherin多克隆抗體、兔抗人N-cadherin多克隆抗體及以兔抗人Vimentin多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，兔抗人Elf5多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，超敏兔兩步法檢測試劑盒(PV-9001)及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 受檢組織WWOX蛋白、Elf5、Snail1及EMT標志分子E-cadherin、N-Cadherin 、Vimentin 檢測方法 將石蠟包埋的受檢組織標本按4 μm厚連續(xù)切片?？酒蠼攵妆矫撓?、梯度乙醇水化。3%過氧化氫室溫孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸鹽高壓抗原修復(fù)。滴加6種抗體稀釋液(均為1∶100)，4 ℃孵育過夜，室溫復(fù)溫1 h，加入超敏兔二步法檢測試劑，37 ℃孵育30 min，DAB顯色。復(fù)染、常規(guī)脫水、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生采用獨立雙盲法閱片，判定免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(WWOX蛋白表達于細胞質(zhì)，Elf5表達于細胞核，Snail1表達于細胞核及胞質(zhì)，E-cadherin表達于細胞膜，N-cadherin表達于細胞膜及細胞質(zhì)，Vimentin表達于細胞質(zhì))。根據(jù)細胞著色程度計分：細胞無色計0分、淡黃色計1分、黃色計2分、棕黃色計3分；根據(jù)細胞著色范圍計分：每個高倍視野觀察100個細胞，計數(shù)每個高倍視野陽性細胞的百分比，陽性細胞百分比<5%計0分、5%～25%計1 分、26%～50%計2 分、51%～75%計3分、>75%計4 分，每例標本隨機選取10個高倍視野(×400倍),取中位值；上述兩分值的乘積為0判為陰性、1～4判為弱陽性(+)、5～8判為中等強度陽性(++)、9以上判為強陽性(+++)，+～+++均為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較用χ2檢驗，相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)分析法，組間生存率比較用Log-Rank檢驗，多因素分析用Cox比例風險回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織及癌旁組織中WWOX蛋白、Elf5、Snail1、EMT標志分子的表達比較 WWOX蛋白、Elf5和E-cadherin在卵巢癌組織中陽性表達率低、癌旁組織陽性表達率高，Snail1、N-cadherin、Vimentin在卵巢癌組織中陽性表達率高、癌旁組織中陽性表達率低；卵巢癌組織及癌旁組織中WWOX蛋白、Elf5、Snail1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達相比，P均< 0.05；詳見表1。

2.2 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5、Snail1、EMT標志分子的表達與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5、Snail1及EMT標志分子的表達與上皮性卵巢癌臨床分期、病理學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡及病理學(xué)類型無關(guān)(P均>0.05)，見表2。

表2 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5、Snail1、EMT標志分子的表達與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5、Snail1、EMT標志分子表達的相互關(guān)系 卵巢癌組織中WWOX蛋白表達陽性的113例中Elf5表達陽性61例、陰性52例，WWOX蛋白表達陰性的187例中Elf5表達陽性47例、陰性140例，兩者表達呈正相關(guān)(r=0.291,P<0.05)。另外，卵巢癌組織中WWOX蛋白與 Snail1、N-cadherin、Vimentin的表達呈負相關(guān)(r分別為-0.785、-0.482、-0.706，P均<0.05)，WWOX蛋白與E-cadherin表達呈正相關(guān)(r=0.759,P<0.05),Elf5與 Snail1、N-cadherin、Vimentin的表達呈負相關(guān)(r分別為-0.816、-0.465、-0.738，P均<0.05)，Elf5與E-cadherin表達呈正相關(guān)(r= 0.726,P<0.05)；詳見表3。

2.4 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5表達與上皮性卵巢癌患者生存及預(yù)后的關(guān)系 本組病例隨訪期間失訪44例，平均5年生存率為22.3%。WWOX蛋白表達陽性與陰性者5年生存率分別為42.5%和15.5%,兩者相比，P<0.05； Elf5表達陽性者與陰性者5年生存率分別為46.3%和9.9%,兩者相比，P<0.05。

將上皮性卵巢癌患者的年齡(分為≥53歲組與<53歲組)、病理學(xué)類型(漿液性癌組、黏液性癌組、子宮內(nèi)膜樣癌組、透明細胞癌組)、FIGO分期(分為Ⅰ期+Ⅱ期組與Ⅲ期+Ⅳ期組)、病理學(xué)分級(G1+G2組與G3組)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(分為轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組)、WWOX蛋白表達(分為陽性組與陰性組)、Elf5表達(分為陽性組與陰性組)等因素引入Cox多因素模型分析顯示，WWOX蛋白、Elf5、FIGO分期、病理學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響上皮性卵巢癌患者預(yù)后的獨立因素，見表4。

表3 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5表達與Snail1及EMT標志分子表達的相關(guān)性(例)

表4 300例上皮性卵巢癌患者預(yù)后影響因素分析結(jié)果

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，因為發(fā)現(xiàn)時大多數(shù)都是晚期，手術(shù)以及其他治療均無法明顯改善卵巢癌患者的預(yù)后[8]。目前卵巢癌的發(fā)病機制尚未完全確定，因此深入研究卵巢癌的發(fā)生機制有利于尋找有效的治療方法[9]。WWOX基因是新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，WWOX蛋白可以與不同的蛋白(如p73, Ap2, ErbB4, c-Jun等)相互作用，也可以參與許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(如腫瘤壞死因子受體相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2介導(dǎo)的凋亡途徑)從而抑制腫瘤的增殖、促進腫瘤細胞的凋亡[10,11]。轉(zhuǎn)錄因子Elf5位于人11號染色體短臂13～15區(qū)，這個區(qū)域在癌癥患者中易發(fā)生雜合性丟失[6]， Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Elf5中E3結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸，具有和蛋白質(zhì)結(jié)合的功能，而WWOX蛋白中的WW1結(jié)構(gòu)域能夠與富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，WWOX蛋白通過此特性可以與Elf5相互作用。Elf5不僅參與細胞的發(fā)育、分化和凋亡過程，并調(diào)控細胞的增殖與腫瘤的發(fā)生[13]。Yan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，WWOX mRNA在卵巢癌組織中的表達低于正常卵巢組織。Qian等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Elf5 mRNA在卵巢癌組織中的表達低于正常卵巢組織。本研究發(fā)現(xiàn)，WWOX蛋白和Elf5在卵巢癌組織中的陽性表達率均低，在癌旁組織中的陽性表達率均高，說明WWOX蛋白和Elf5的低表達可能與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)。

EMT是卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥發(fā)生中的一個非常關(guān)鍵的步驟，是指在某些特殊的生理或病理情況下不能移動的具有極性的上皮細胞被可以移動有遷移能力的間質(zhì)細胞所代替，同時上皮細胞擁有間質(zhì)細胞的表型[16]。EMT過程的發(fā)生受到多種生長因子及多條信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的共同調(diào)節(jié)，如Snail1/E-cadherin信號通路[17]。在卵巢癌中，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1表達增加可以通過與EMT標志分子E-cadherin上的啟動子E-box相結(jié)合，抑制 E-cadherin的表達,使細胞無法黏附在一起，從而誘導(dǎo)卵巢癌的發(fā)生并產(chǎn)生侵襲性[18]；同時，EMT間葉性標志物N-Cadherin和Vimentin表達增加，使腫瘤細胞之間變疏松而容易發(fā)生遷移和擴散[19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在卵巢癌組織中低表達，Snail1、N-Cadherin及Vimentin在卵巢癌組織中高表達，與上述研究結(jié)果一致，符合卵巢癌EMT過程中的分子生物學(xué)特征。本研究還發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中WWOX蛋白、Elf5表達越低，EMT現(xiàn)象越嚴重，臨床上表現(xiàn)為病理學(xué)分級越高、病理分期越晚、越容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后越差。

總之，本研究結(jié)果表明，上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織中WWOX蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Elf5 和Snail1、EMT標志分子的表達發(fā)生變化，而且其表達存在相關(guān)性，WWOX蛋白及Elf5的表達與上皮性卵巢癌患者的生存及預(yù)后相關(guān)。WWOX基因作為抑癌基因，其表達的缺失可能促進了卵巢癌的EMT現(xiàn)象，進一步促進卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。WWOX也有望成為卵巢癌早期篩查的指標以及生物治療的新靶點。然而卵巢癌發(fā)生的分子生物學(xué)機制是多步驟、多基因調(diào)控的過程，WWOX抑制卵巢癌的EMT過程的具體機制還有待于更深入的研究。