李 偉 劉 娜 孫巨勇 姚新潔 李慶祿 李新國(guó)

(哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院檢驗(yàn)科，衡水053000)

肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率分別位居惡性腫瘤第四位與第二位[1]。大多數(shù)惡性腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中，通常伴隨著部分內(nèi)部腫瘤組織存在缺氧現(xiàn)象[2]。研究表明，缺氧是實(shí)體腫瘤的特征之一，缺氧有助于腫瘤內(nèi)的免疫抑制，幫助癌細(xì)胞逃避免疫攻擊及抑制免疫殺傷功能[3]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是癌細(xì)胞在缺氧條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤生長(zhǎng)、血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4,5]。陸曄斌等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中HIF-1α可能負(fù)調(diào)控MICA/B的表達(dá)，進(jìn)而參與低氧對(duì)胰腺癌免疫抑制的調(diào)控。肝癌組織中HIF-1α表達(dá)異常增高，且與患者的無瘤生存時(shí)間密切相關(guān)[7]。然而，在肝癌中HIF-1α是否參與缺氧誘導(dǎo)的免疫抑制仍不完全清楚。本研究將通過缺氧誘導(dǎo)小鼠荷瘤模型，研究缺氧組織中HIF-1α及相關(guān)腫瘤免疫因子表達(dá)，構(gòu)建沉默HIF-1α小鼠Hepa1-6細(xì)胞移植瘤模型，觀察敲減HIF-1α后腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞及免疫因子表達(dá)變化，以期揭示缺氧誘導(dǎo)肝癌免疫逃逸的分子機(jī)制，為臨床尋找診治惡性腫瘤方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，健康SPF級(jí)C57BL/6小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；HIF-1α、GAPDH抗體購(gòu)自CST公司；FITC-CD4小鼠抗體、APC-CD25小鼠抗體和PE-Foxp3小鼠抗體購(gòu)自eBioscience公司；TRIzol、Script Ⅱ reverse transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR green master mix試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞穩(wěn)定株篩選 將化學(xué)合成的shHIF-1α核苷酸序列克隆至pLKO.1-puro質(zhì)粒中，構(gòu)建敲減HIF-1α慢病毒載體pLKO.1-shHIF1α，并包裝慢病毒。取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hepa1-6細(xì)胞接種于6孔板中，待培養(yǎng)過夜達(dá)30%時(shí)，加入慢病毒感染細(xì)胞，20 h后換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，培養(yǎng)液中加入1 μg/ml的嘌呤霉素溶液進(jìn)行篩選，每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)液，約1個(gè)月后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定并保種。敲減HIF-1α的核苷酸序列為：5′-CTG ATG ACC AGC AAC TTG A-3′。

1.2.3皮下移植 取6周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠20只，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hepa1-6細(xì)胞，消化后用無血清DMEM稀釋成1×107ml-1，注射器吸取200 μl接種于小鼠右腋皮下。將小鼠隨機(jī)分為2組，常氧飼養(yǎng)組和缺氧飼養(yǎng)組，常氧飼養(yǎng)條件:21%O2、5%CO2、74%N2;缺氧飼養(yǎng)條件:10%O2、5%CO2、85%N2;缺氧飼養(yǎng)采用12/12 h晝夜循環(huán)方式，缺氧時(shí)間具體為:早8:00～晚20:00[8]。

另取20只C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為2組，每組10只，將Control和shHIF-1α細(xì)胞消化稀釋1×107ml-1，注射器吸取200 μl接種于小鼠右腋皮下，分別記為Control組和shHIF-1α組。約6周后，將小鼠安樂死并收集所有的移植瘤用于免疫細(xì)胞分析或基因表達(dá)分析。

1.2.4免疫組化分析 小鼠處死前1 h腹腔注射60 mg/kg 的缺氧探針HypoxyprobeTM-1，根據(jù)試劑盒說明書，經(jīng)免疫組化染色分析其表達(dá)和分布區(qū)域。另采用免疫組化法檢測(cè)小鼠移植瘤組織HIF-1α表達(dá)情況，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.5qPCR檢測(cè) 取移植瘤組織采用TRIzol試劑提取各組總RNA，Nanodrop 2000測(cè)各組RNA濃度，并按照Script Ⅱ reverse transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用2×SYBR green master mix試劑盒qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞腫瘤抑制因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10以及腫瘤促進(jìn)因子IL-10、IL-1β和IL-17相對(duì)表達(dá)量[9-12]。引物如下：IFN-γ：F-5′-TTT GAG GTC AAC AAC CCA CAG GTC-3′、R-5′-TTT CCG CTT CCT GAG GCT GGA TT-3′；IL-12b：F-5′-GGA AGC ACG GCA GCA GAA TA-3′、R-5′-AAC TTG AGG GAG AAG TAG GAA TGG-3′；CXCL10:F-5′-TGC AAG TCT ATC CTG TCC GCA TGT-3′、R-5′-CCT TCT TTG GCT CAC CGC TTT CAA-3′；IL-10：F-5′-CTG TCA TCG ATT TCT CCC TGT GAG-3′、R-5′-TGA GTG TCA CGT AGG CTT TCA TGC-3′；IL-1β：F-5′-CAA CCA ACA AGT GAT ATT CTC CAT G-3′、R-5′-GAT CCA CAC TCT CCA GCT GCA-3′；IL-17：F-5′-TCT GAG CCA GCC AAG AAG AAG TGT-3′、R-5′-TTC CAA CCC AAA CAT AGG CAC-3′；β-actin：F-5′-AGC TGT GCT ATG TTG CCC TAG ACT-3′、R-5′-ACC GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA-3′。

1.2.6Western blot檢測(cè) 用RIPA裂解液抽提移植瘤組織蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗37℃孵育2 h，最后用電化學(xué)發(fā)光曝光顯影，以GAPDH表達(dá)為內(nèi)參。

1.2.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)移植瘤組織CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量 獲取移植瘤組織，剪去結(jié)締組織，RPMI1640培養(yǎng)基沖洗干凈，眼科剪將移植瘤剪成1～2 mm3小塊，置于含膠原酶的消化液中，于37℃培養(yǎng)箱消化1 h，后用100目篩網(wǎng)過濾去除未消化好的組織塊，將得到的細(xì)胞懸液50 g離心1 min，以去除殘留組織塊。取上清移至新的離心管中，400 g離心10 min，用2 ml RPMI1640重懸細(xì)胞。取新離心管依次加入70% percoll和40%percoll各4 ml，沿管壁將細(xì)胞懸液緩慢加至分離液上面，2 000 r/min離心20 min，將位于70% percoll和40%percoll界面的淋巴細(xì)胞移至新離心管中，RPMI-1640洗滌細(xì)胞2次以去除殘留淋巴細(xì)胞分離液。

調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107ml-1，取5只流式管，分別記為空白、CD25同型對(duì)照、CD4CD25、Foxp3同型對(duì)照、CD4CD25Foxp3，于各管中分別加入100 μl細(xì)胞懸液。各管分別加入CD4、CD25抗體及同型對(duì)照，空白管不加任何抗體，CD25同型對(duì)照管加CD4抗體和CD25同型對(duì)照抗體，CD4CD25管加CD4抗體和CD25抗體，F(xiàn)oxp3同型對(duì)照管加CD4抗體和CD25抗體，CD4CD25Foxp3加CD4抗體和CD25抗體，混勻，4℃避光孵育30 min，混勻4℃避光孵育30 min，加2 ml染色緩沖液1 500 r/min離心5 min洗滌細(xì)胞2次，邊渦旋邊加冷固定/穿膜劑1 ml，4℃避光孵育30 min～18 h，加穿膜緩沖液2 ml，1 200 r/min×5 min離心洗滌2次，棄上清液?？瞻?、CD25同型對(duì)照、CD4CD25管用300～400 μl染色緩沖液懸浮，混勻避光待測(cè)。Foxp3同型對(duì)照、CD4CD25Foxp3管中分別加入穿膜緩沖液稀釋的Foxp3同型對(duì)照抗體或抗體，4℃避光孵育30 min，穿膜劑緩沖液2 ml，1 200 r/min離心5 min洗滌細(xì)胞2次，用300～400 μl染色緩沖液重懸后于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1HIF-1α在缺氧肝移植瘤組織中的表達(dá) 本研究利用低氧探針標(biāo)記缺氧組織，免疫組化檢測(cè)肝移植瘤非缺氧組織和缺氧組織HIF-1α表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，缺氧組織中HIF-1α表達(dá)顯著高于非缺氧組(1.09±0.23，3.44±0.45；t=14.704 7，P=0.000 0)，結(jié)果表明，HIF-1α在缺氧肝移植瘤組織中高表達(dá)(見圖1)。

2.2缺氧肝移植瘤組織中免疫因子表達(dá) 最近研究表明，缺氧/HIF-1α信號(hào)能夠抑制宿主抵御癌癥[13,14]。為了證實(shí)這一觀點(diǎn)，我們檢測(cè)了肝移植瘤缺氧組織炎癥和免疫因子的表達(dá)，結(jié)果如表1顯示，與非缺氧組織相比，抗腫瘤因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10表達(dá)水平顯著降低(tIFN-γ=4.031 9，PIFN-γ=0.000 8；tIL-12b=4.889，PIL-12b=0.000 1；tCXCL10=2.212 9，PCXCL10=0.040 1)，相反，腫瘤促進(jìn)因子IL-10、IL-1β和IL-17表達(dá)顯著增加(tIL-10=2.931 6，PIL-10=0.008 9；tIL-1β=8.723，PIL-1β=0.000 0；tIL-17=3.650 7，PIL-17=0.001 8)。結(jié)果表明，腫瘤缺氧與免疫抑制有關(guān)，見圖2。

2.3構(gòu)建敲減HIF-1α的肝移植瘤 結(jié)果如圖2所示，與Control組相比，敲減HIF-1α后肝癌細(xì)胞Hepa1-6小鼠移植瘤瘤重明顯降低(1.47±0.12，0.48±0.03，t=25.309 8，P=0.000 0)，抑制了腫瘤生長(zhǎng)。

2.4沉默HIF-1α的移植瘤中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞表達(dá)變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默HIF-1α的移植瘤中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量較Control組明顯降低(13.80±2.43，2.97±1.15，t=12.739 1，P=0.000)，見圖3。

圖1 HIF-1α在缺氧與非缺氧肝移植瘤組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of HIF-1α in hypoxic and non-hypoxic liver xenograftsNote: Compared with non-hypoxic group,*.P<0.05.

GroupsThe relative level of immune factorsIFN-γIL-12bCXCL10IL-10IL-1βIL-17Hon-hypoxic tissues group0.006 22±0.003 410.002 23±0.001 320.002 85±0.001 460.001 95±0.001 350.001 14±0.000 240.000 31±0.000 69Hypoxic tissues group0.001 82±0.000 531)0.000 15±0.000 261)0.001 74±0.000621)0.004 28±0.002 121)0.008 37±0.002 611)0.002 05±0.001 341)

Note：1)P<0.05 compared to non-hypoxic tissues group.

GroupsThe relative level of immune factorsIFN-γIL-12bCXCL10IL-10IL-1βIL-17Control group0.007 84±0.001 410.002 13±0.000 920.029 8±0.002 60.001 36±0.000 340.005 36±0.000 720.000 63±0.000 31shHIF-1α group0.013 97±0.001 451)0.004 46±0.001 021)0.052 4±0.013 21)0.004 65±0.002 121)0.009 61±0.003 011)0.001 34±0.000 261)

Note：1)P<0.05 compared to Control group.

圖2 敲減HIF-1α抑制小鼠肝癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)Fig.2 Knockdown of HIF-1α inhibited growth of mouse hepatoma cell xenograftsNote: A.The relative tumor weight;B.The expression of HIF-1α in the transplanted tumor was detected by Western blot;compared with Control group,*.P<0.05.

2.5沉默HIF-1α的移植瘤中免疫因子表達(dá)變化 移植瘤中免疫因子表達(dá)結(jié)果如表2所示，與Control組相比，敲減HIF-1α后移植瘤組織中抗腫瘤因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10表達(dá)水平顯著增加(tIFN-γ=9.584 4，PIFN-γ=0.000 0；tIL-12b=5.364 1，PIL-12b=0.000 0；tCXCL10=5.312 1，PCXCL10=0.000 0)，相反，腫瘤促進(jìn)因子IL-10、IL-1β和IL-17表達(dá)顯著降低(tIL-10=4.845 6，PIL-10=0.000 1；tIL-1β=4.342 5，PIL-1β=0.000 4；tIL-17=5.549 2，PIL-17=0.000 0)。由此可知，腫瘤組織中HIF-1α表達(dá)與免疫抑制有關(guān)。

3 討論

肝癌是常見惡性腫瘤，其發(fā)病率居全世界惡性腫瘤第5位，死亡率高居第3位[15]，而在我國(guó)無論發(fā)病率還是死亡率均居惡性腫瘤第二位，且我國(guó)每年因肝癌死亡人數(shù)多達(dá)23萬，約占全球肝癌死亡人數(shù)的55%，我國(guó)是一個(gè)肝癌大國(guó)[16,17]。由于肝癌早期無癥狀不明顯，病情進(jìn)展迅速，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期失去治療機(jī)會(huì)，僅有部分患者能夠進(jìn)行手術(shù)切除等根治性治療，但這部分患者術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)60%～70%，預(yù)后極差[18,19]。因此，急需對(duì)肝癌惡化機(jī)制進(jìn)行深入研究，尋找理想的治療靶標(biāo)。

缺氧是實(shí)體腫瘤的特征之一，缺氧微環(huán)境能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中與増殖、分化、凋亡、能量代謝、血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移及放化療耐受等相關(guān)癌基因表達(dá)，來維持癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等惡性表型[20,21]。HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠影響多種原癌基因、腫瘤免疫因子的表達(dá)，如VEGF、IL-8、IL-6及TNF-α等，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。大量研究表明，HIF-1α在乳腺癌、胃癌及肝癌等腫瘤組織中異常高表達(dá)，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期等預(yù)后指標(biāo)相關(guān)[22-25]，HIF-1α在肝癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本研究通過構(gòu)建肝移植瘤缺氧模型并利用缺氧探針進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)相較于非缺氧組織，缺氧組織中HIF-1α顯著高表達(dá)，這與先前研究結(jié)論一致[7]。癌細(xì)胞逃避免疫應(yīng)答的能力對(duì)于腫瘤惡性表型出現(xiàn)是至關(guān)重要的[26]。缺氧有助于腫瘤內(nèi)的免疫抑制，幫助癌細(xì)胞逃避免疫攻擊以及抑制免疫殺傷功能[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，與非缺氧組織相比，缺氧組織中腫瘤抑制因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10低表達(dá)，腫瘤促進(jìn)因子IL-10、IL-1β和IL-17高表達(dá)。上述結(jié)果提示，缺氧誘導(dǎo)HIF-1α高表達(dá)可能與腫瘤免疫抑制有關(guān)。

圖3 移植瘤組織中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量Fig.3 Content of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in xenograft tumorsNote: Compared with Control group,*.P<0.05.

研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制細(xì)胞在腫瘤的低氧區(qū)積累，能夠激活癌細(xì)胞免疫耐受機(jī)制使其逃避宿主免疫監(jiān)視促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[13,28]。本研究構(gòu)建了穩(wěn)定敲減HIF-1α的Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞移植瘤模型，敲減HIF-1α后腫瘤生長(zhǎng)顯著抑制，并且腫瘤浸潤(rùn)免疫抑制細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯著降低，腫瘤促進(jìn)因子IL-10、IL-1β和IL-17表達(dá)也明顯降低，相反腫瘤抑制因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10表達(dá)顯著增加。上述結(jié)果表明，沉默HIF1-α表達(dá)可逆轉(zhuǎn)肝癌免疫抑制。本研究通過構(gòu)建小鼠動(dòng)物模型揭示了HIF1-α在肝癌免疫抑制中的作用，進(jìn)一步揭示了缺氧誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制的分子機(jī)制，為將來尋找診治惡性腫瘤手段提供了一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。