高海娜，蔡周權(quán)，林鶯，文霞，孫慧峰

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松脂醇二葡萄糖苷對(duì)光老化HDF細(xì)胞ER/TGF-β1/Smads信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制

高海娜，蔡周權(quán)，林鶯，文霞，孫慧峰

621000 綿陽(yáng)，四川省科學(xué)城醫(yī)院藥劑科（高海娜、蔡周權(quán)、林鶯、文霞）；150040 哈爾濱，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（孫慧峰）

從分子生物學(xué)水平探討杜仲中松脂醇二葡萄糖苷（PDG）對(duì)光老化人真皮成纖維細(xì)胞（HDF）ER/TGF-β1/Smads 信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。

建立以長(zhǎng)波紫外線模型損傷 HDF 細(xì)胞。給予不同濃度 PDG 和通路阻斷劑進(jìn)行干預(yù)，用MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖率，Real time-PCR 和 Western blot 法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)含有的信號(hào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）、轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（Smad3）、I 型膠原（COL1A1）對(duì)應(yīng) mRNA 和蛋白的表達(dá)。

與空白組比較，模型組增殖率及 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著降低（< 0.01）；與模型組比較，各給藥組增殖率和 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著升高（< 0.01）；與 PDG 高濃度組比較，TGF-β1、Smad3、ER 三個(gè)阻斷劑組相對(duì)應(yīng)的 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 相應(yīng) mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著降低（< 0.01）。

PDG 能增加 HDF 細(xì)胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 對(duì)應(yīng) mRNA 和蛋白表達(dá)，對(duì)光老化 HDF 細(xì)胞膠原合成有促進(jìn)作用；但這種作用能被 TGF-β1、Smad3 和 ER 阻斷劑所抑制，PDG 促進(jìn)膠原合成的作用機(jī)制可能與 ER/TGF-β1/Smads 信號(hào)通路有關(guān)。

松脂醇二葡萄糖苷； 人真皮成纖維細(xì)胞； 植物雌激素； ER/TGF-β1/Smads 信號(hào)通路

長(zhǎng)波紫外線（UVA）可以導(dǎo)致表皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞以及真皮的纖維細(xì)胞構(gòu)型異常的轉(zhuǎn)變[1-4]。杜仲對(duì)正常成纖維細(xì)胞 I 型膠原蛋白有保護(hù)作用，但具體成分還不明確[5-6]。杜仲中松脂醇二葡萄糖苷（pinoresinol diglucoside，PDG）是一種天然弱雌激素樣物質(zhì)，它與皮膚光老化有密切關(guān)系。有研究揭示光老化患者皮膚中雌激素受體β（ERβ）的表達(dá)強(qiáng)度和老化的嚴(yán)重程度有著密切的關(guān)系，雌激素受體在光老化患者皮膚中發(fā)揮了重要作用[7-8]。Smads 蛋白家族是一種轉(zhuǎn)錄因子，它是 TGF-β 受體作用的中介物質(zhì)[9-10]。Son 等[11]報(bào)道 17β 雌二醇（E2），可促進(jìn)TGF-β1 和 Smad3 表達(dá)增加，使膠原合成增加，表明在 TGF-β/Smad 信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制中 17β 雌二醇促進(jìn)了膠原的合成，可用于治療人的皮膚病。膠原合成主要通過 ER/TGF-β/Smads 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，植物雌激素成分干預(yù)膠原蛋白合成的作用機(jī)制為合理利用中藥植物促激素預(yù)防皮膚光老化等疾病提供理論依據(jù)[12]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人真皮成纖維細(xì)胞（HDF）購(gòu)自美國(guó) Sciencell 公司。

1.1.2 試劑 17β 雌二醇純度為 98%，購(gòu)買于北京百靈威科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為 L750N46；PDG 純度為 98%，購(gòu)買于寶雞市辰光生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為 MUST-13021001；COL1A1 阻斷劑 SB431542（生產(chǎn)批號(hào)301836-41-9）和Smad3 阻斷劑 SIS3（生產(chǎn)批號(hào) 1009104-85-1）以及TGF-β1、COL1A1、Smad3、HRP 標(biāo)記羊抗兔 IgG 均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnogy；TGF-β1 阻斷劑 ICI182780（生產(chǎn)批號(hào) 20A/129473）購(gòu)自 Tocris 公司；HRP 標(biāo)記羊抗小鼠 IgG 購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 UVA 紫外照射儀購(gòu)自北京師范光電儀器廠；MK3 型酶標(biāo)儀購(gòu)自上海熱電儀器有限公司；WD9405B 型水平搖床購(gòu)自北京市六一儀器廠；TCL6G-C 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；Mini-Protean Tetra Cell 型電泳儀購(gòu)自Bio-Rad 公司；PCR 自動(dòng)擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Biometra 公司；Smart ChemiTM500 型一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀和ChamlGelTM5000 透射紫外觀察儀及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的 HDF 細(xì)胞，以 105每孔接種到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2條件下，用 FM 培養(yǎng)液培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組為空白組（2 ml FM + 培養(yǎng) 24 h）、模型組（2 ml FM + 培養(yǎng) 23 h + 20 J/cm2UVA 照射 + 培養(yǎng) 1 h）、陽(yáng)性對(duì)照組（10-3μmol/L 雌二醇 + 2 ml FM + 培養(yǎng)23 h + 20 J/cm2UVA 照射 + 培養(yǎng) 1 h）、藥物低劑量組/ 藥物中劑量組/ 藥物高劑量組（10-1μmol/L /1 μmol/L / 10 μmol/L PDG + 2 ml FM + 培養(yǎng) 23 h+ 20 J/cm2UVA 照射 + 培養(yǎng) 1 h）、阻斷劑組（1 μmol/L ICI182780 / 10 μmol/L SIS3 / 10 μmol /L SB431542 培養(yǎng) 1 h + 10 μmol/L PDG + 2 ml FM + 培養(yǎng) 22 h + 20 J/cm2UVA 照射 + 培養(yǎng) 1 h），每組均設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 MTT 檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng) 20 h 后，每孔加入 20 μl 濃度為 5 g/L 的 MTT，再繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，除去上清液，每孔加 150 μl DMSO，將 96 孔板置于 37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)器內(nèi)振蕩 10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀 490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.3 Real time-PCR 反應(yīng) 取對(duì)數(shù)增長(zhǎng) HDF 細(xì)胞，使用裂解液提取總的 RNA，用 Nano-100 測(cè)定總 RNA 的濃度及純度，將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 置于–20 ℃冰箱儲(chǔ)存待用，選 GAPDH 為內(nèi)參，引物序列見表 1，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 30 s；58 ℃退火/延伸60 s，2 ℃延伸 60 s，31 個(gè)循環(huán)；2 ℃延伸 60 s。然后每孔 10 μl 將擴(kuò)增產(chǎn)物加入到瓊脂糖凝膠進(jìn)行 120 V 30 min 電泳，最后在凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，循環(huán)閾值即 Ct 值，每組設(shè)三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。按照 2-△△Ct法分析細(xì)胞內(nèi)目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量?！鳌鰿t =（Ct目的基因– Ct內(nèi)參基因）給藥組–（Ct目的基因– Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組。

1.2.4 Western blot 取對(duì)數(shù)增長(zhǎng) HDF 蛋白濃度，計(jì)算出樣品蛋白濃度，將 10 μl 蛋白樣品加入對(duì)應(yīng)的膠孔中，電泳儀電壓為 100 V，電泳 60 min。半干轉(zhuǎn)膜儀電壓為 10 V，轉(zhuǎn)染 0.5 h。脫脂奶粉封閉 2 h，一抗（1:330）孵育 4 ℃過夜，TBST 洗3 遍，二抗（1:10000）孵育 1 h，TBST 再洗 3 遍，將 PVDF 膜稍微淋一下，加 ECL 顯色，暗室顯影，攝影并進(jìn)行分析。采用 LaneID 凝膠分析系統(tǒng)，分析各條帶的灰度值，以靶條帶的灰度值和內(nèi)參的灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 采用 MTT 法檢測(cè) PDG 對(duì) UVA 照射 HDF 細(xì)胞增殖作用的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 2，與空白組相比，模型組的 HDF 細(xì)胞增殖率顯著減少（< 0.01）；與模型組相比，PDG 低中高（10-1μmol/L、1 μmol/L 和10 μmol/L）三種劑量對(duì) HDF 細(xì)胞的增殖率均具有促進(jìn)作用（< 0.05）。

2.2 PDG 對(duì)光老化 HDF 細(xì)胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 3，與空白組相比，模型組中 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 mRNA 表達(dá)均顯著減少（< 0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和 PDG 高劑量組 TGF-β1、Smad3 和COL1A1 mRNA 表達(dá)均顯著增加（< 0.01）。

2.3 PDG 對(duì)光老化 HDF 細(xì)胞 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 蛋白表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 4 和圖 1，與空白組相比，模型組 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表達(dá)均顯著減少（< 0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和PDG 低劑量組、中劑量組、高劑量組中 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表達(dá)均顯著增加（< 0.01）。

表 1 引物

表 2 PDG 對(duì) UVA 照射 HDF 細(xì)胞增殖率的影響（，n = 6）

注：與空白組比較##< 0.01；與模型組比較*< 0.05。

Note: Compared with the blank group,##< 0.01; compared with the model group,*< 0.05.

表 3 PDG 對(duì)光老化 HDF 細(xì)胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達(dá)的影響（，n = 3）

注：與空白組比較##< 0.01；與模型組比較**< 0.01。

Note: Compared with the blank group,##< 0.01; compared with the model group,**< 0.01.

表 4 PDG 對(duì)光老化 HDF 細(xì)胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白表達(dá)的影響（，n = 3）

注：與空白組比較##< 0.01；與模型組比較**< 0.01。

Note: Compared with the blank group,##< 0.01; compared with the model group,**< 0.01.

A: Control; B: UVA + E2 (10-3μmol/L); C: 20 J/cm2UVA; D: UVA + PDG (10-1μmol/L); E: UVA + PDG (1 μmol/L); F: UVA + PDG (10 μmol/L)

Figure 2 Effect of PDG on expression of TGF-β1, Smad3 and COL1A1 protein in photo-aging HDF cells

2.4 阻斷 ER/TGF-β1/Smads 后 PDG 對(duì)光老化HDF 細(xì)胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 5，與空白組相比，模型組中TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達(dá)均顯著減少（< 0.01）；與模型組相比，PDG 高劑量組 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達(dá)均顯著增加（< 0.01）；與 PDG 高劑量組相比，TGF-β1 阻斷劑 SB431542、Smad3 阻斷劑 SIS3、雌激素受體阻斷劑 ICI182780相對(duì)應(yīng)的 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 mRNA 表達(dá)均顯著減少（< 0.01）。

表 5 阻斷 ER/TGF-β1/Smads 后 PDG 對(duì)光老化 HDF 細(xì)胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表達(dá)的影響（，n =3）

注：與空白組比較##< 0.01；與模型組比較**< 0.01；與藥物高劑量組比較#< 0.01。

Note: Compared with the blank group##< 0.01; compared with the model group**< 0.01; compared with the high dose group#< 0.01.

組別 GroupsTGF-β1/β-actinSmad3/β-actinCOL1A1/β-actin 空白組 Control0.636 ± 0.0140.889 ± 0.0120.982 ± 0.042 UVA0.234 ± 0.019##0.262 ± 0.018##0.331 ± 0.023## UVA + PDG0.462 ± 0.013**0.501 ± 0.016**0.564 ± 0.018** UVA + PDG + SB4315420.275 ± 0.018#0.392 ± 0.017#0.438 ± 0.015# UVA + PDG + SIS30.282 ± 0.023#0.301 ± 0.011#0.430 ± 0.068# UVA + PDG + ICI1827800.322 ± 0.016#0.332 ± 0.021#0.392 ± 0.026#

注：與空白組比較##< 0.01；與模型組比較**< 0.01；與藥物高劑量組比較#< 0.01。

Note: Compared with the blank group##< 0.01; compared with the model group**< 0.01; compared with the high dose group#< 0.01.

A: Control; B: UVA; C: UVA + PDG; D: UVA + PDG + SB431542; E: UVA + PDG + SIS3; F: UVA + PDG + ICI182780

Figure 2 Influence of PDG on expression of TGF-β1, Smad3 and COL1A1 proteins in photoaging HDF cells after blocking ER/TGF-β1/Smads

2.5 阻斷ER/TGF-β1/Smads后PDG對(duì)光老化HDF細(xì)胞TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 6 和圖 2，與空白組相比，模型組中 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表達(dá)均顯著減少（< 0.01）；與模型組相比，PDG 高劑量組 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表達(dá)均顯著增加（< 0.01）；與 PDG 高劑量組相比，TGF-β1 阻斷劑 SB431542、Smad3阻斷劑 SIS3、雌激素受體阻斷劑 ICI182780相對(duì)應(yīng)的 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 蛋白的表達(dá)均顯著減少（< 0.01）。

3 討論

皮膚的光老化嚴(yán)重影響人們的容顏，給人身體造成嚴(yán)重心理負(fù)擔(dān)。皮膚光老化主要發(fā)病的原因是膠原合成減少，而膠原合成主要通過 ER/TGF-β/Smads 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，其中 TGF-β1、Smad3、I 型膠原在 HDF 細(xì)胞中的表達(dá)可以作為評(píng)估光老化模型的特異性指標(biāo)[13-15]。選擇植物雌激素來研究其對(duì)膠原合成的影響及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于尋找安全有效的治療皮膚光老化的天然植物類藥物具有重大意義。

綜上所述，PDG 能通過影響 ER/TGF-β1/Smads 信號(hào)通路顯著上調(diào) UVA 誘導(dǎo)的光老化 HDF 細(xì)胞 TGF-β1、Samd3、COL1A1 蛋白及 mRNA 的表達(dá)，增加光老化 HDF 細(xì)胞的增殖能力，為中藥治療光老化等皮膚疾病提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Regulatory role of pinoresinol diglucoside in the ER/TGF-β1/Smads signaling pathways in photo-aged HDF cells

GAO Hai-na, CAI Zhou-quan, LIN Ying, WEN Xia, SUN Hui-feng

Sichuan Science City Hospital, Mianyang 621000, China (GAO Hai-na, CAI Zhou-quan, LIN Ying, WEN Xia); Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China (SUN Hui-feng)

To study the effect of pinoresinol diglucoside (PDG) on the ER/TGF-β1/Smads signaling pathways in photo-aged human dermal fibroblasts (HDF) cells.

A long wave ultraviolet (UVA) model was established to damage the HDF cells, and different concentrations of PDG and ER/TGF-β1/Smads signaling pathway inhibitors were added. The cell proliferation rate was detected by MTT, and the expression of signal transforming growth factor (TGF- β1), transduced molecule (Smad3) and type I collagen (COL1A1) expression were detected by RT-PCR and Western blot method.

Compared with the control group, the proliferation rate and the expression of TGF-β1, Smad3, COL1A1 mRNA and protein in the UVA irradiated model group were significantly decreased (< 0.01). Compared with the model group, the proliferation rate and TGF-β1, Smad3, and COL1A1 expression were significantly increased after PDG treatment (< 0.01). Compared with the high concentration of PDG group, the expression of TGF-β1, Smad3, and COL1A1 expression were significantly decreased, respectively, upon the treatment with respective inhibitor (< 0.01).

PDG increased the expression of TGF- β1, Smad3 and COL1A1 in HDF cells after UVA irradiation, and this effect can be inhibited by TGF-β1, Smad3 and ER inhibitor.

Pinoresinol diglucoside; Human dermal fibroblasts cells; Phyto-oestrogens; ER/TGF-β1/Smad3 signaling pathway

SUN Hui-feng, Email: huifengsun@hotmail.com

孫慧峰，Email：huifengsun@hotmail.com

2018-07-23

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.007