郭雷雷，徐郁蕊，張 蕾，董怡文，林舒婷，寧興海*，劉瀟璇**

(1中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，南京210009；2中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院高端藥物制劑與材料研究中心，南京 210009；3南京大學(xué)現(xiàn)代工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院，南京 210093)

人體細胞為維持正常的新陳代謝和活性功能，需要周圍環(huán)境提供足夠的氧氣和養(yǎng)分。但實體腫瘤具有與正常組織不同的結(jié)構(gòu)特征[1-2]，導(dǎo)致腫瘤細胞形態(tài)、分化、細胞與基質(zhì)間的相互作用，以及細胞與細胞間的相互作用發(fā)生了極大的變化，與正常細胞存在顯著差異(圖1)。例如，實體腫瘤內(nèi)細胞增殖快于血管生成，加上腫瘤血管組織的特殊結(jié)構(gòu)[3]和血液流動的不規(guī)則性，導(dǎo)致實體腫瘤內(nèi)部缺乏足夠的養(yǎng)分和氧氣[4]。另外，腫瘤組織的一些其他特性，比如，缺少有效的淋巴管和血管、腫瘤組織內(nèi)壓(IFP)較高[5]、細胞外基質(zhì)致密[6]，都導(dǎo)致了實體瘤內(nèi)部物質(zhì)交換的降低，所以使細胞無法進行正常的新陳代謝。由于體內(nèi)實體腫瘤具有上述的基本特征，傳統(tǒng)的二維腫瘤細胞培養(yǎng)模型不能很好地模擬這些實體瘤內(nèi)部的微環(huán)境和細胞之間的相互作用，所以培養(yǎng)的細胞與體內(nèi)的腫瘤細胞所處的微環(huán)境和狀態(tài)都存在極大的差異(表1)。

圖1體內(nèi)實體腫瘤生理特征

宮頸癌(A)和結(jié)腸癌(B)瘤內(nèi)以血管為中心的周圍不同狀態(tài)腫瘤細胞的切片染色；(C)體內(nèi)實體腫瘤內(nèi)氧氣濃度、營養(yǎng)物質(zhì)、能量和藥物濃度梯度分布示意圖

表1 二維腫瘤細胞、三維腫瘤球和體內(nèi)實體瘤主要特征比較

特 征二維細胞三維細胞體內(nèi)實體瘤氧氣,營養(yǎng),代謝廢物濃度梯度?√√乏氧環(huán)境?√√組織區(qū)域的增殖、靜止和壞死?√√腫瘤干細胞生態(tài)位?√√葡萄糖交換速率低高高基因表達不同相似相似

“√”代表存在，“×”代表不存在

因此，采用在三維條件下培養(yǎng)的腫瘤球(tumor spheroids)模型來真實地模擬體內(nèi)實體瘤細胞得到了越來越多的關(guān)注[7-8]。三維腫瘤球具有與體內(nèi)實體瘤相似的增殖曲線、細胞異質(zhì)性、信號通路和基因表達特性，能形成與體內(nèi)實體瘤相似的梯度生理環(huán)境，近年來被廣泛用于腫瘤細胞形態(tài)、腫瘤微環(huán)境、腫瘤干細胞富集、藥物篩選評價等方面的研究，特別是在耐藥機制研究中得到了極大的關(guān)注[7，9]。

腫瘤耐藥是影響腫瘤治療的主要原因之一[10]，鑒于三維腫瘤球與體內(nèi)實體瘤的相似性，利用三維腫瘤球探討腫瘤耐藥產(chǎn)生的機制，以及開發(fā)克服耐藥機制的方法，對臨床抗腫瘤治療意義重大。與二維細胞相比，三維腫瘤球細胞具有更加耐藥的特性，已有研究對其耐藥產(chǎn)生的機制進行了大量探討[11-13]。本文從三維腫瘤球的結(jié)構(gòu)特征出發(fā)，探討三維腫瘤球中細胞間以及細胞外的微環(huán)境對三維腫瘤球的耐藥機制的影響，期望可以為更進一步研究腫瘤細胞增殖、分化、耐藥機制及臨床藥物篩選提供更好的研究方法。

1 三維腫瘤球的結(jié)構(gòu)特征

三維腫瘤球直觀反映了細胞間以及細胞與胞外基質(zhì)間的相互作用，是腫瘤研究中最好的體外模型之一，因此，近年來開發(fā)出許多三維腫瘤球的培養(yǎng)方法，如液體覆蓋培養(yǎng)法(liquid overlay cultures)、懸滴培養(yǎng)法(hanging drop cultures)、旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法(spinner flask culture)、NASA生物反應(yīng)器法(NASA bioreactor)以及微陣列技術(shù)(micro-/nano-technology)等[14-15]。這些培養(yǎng)方法操作簡便、可重復(fù)性強，但也各具優(yōu)缺點。例如，液體覆蓋法和懸滴培養(yǎng)法可以制備單個腫瘤球，且腫瘤球培養(yǎng)成功率較高，但總的腫瘤球產(chǎn)量不高。旋轉(zhuǎn)瓶法和生物反應(yīng)器法可以制備大量的腫瘤球，但腫瘤球大小不勻且培養(yǎng)時間較長。

由于細胞本身內(nèi)在特性和培養(yǎng)方式不同，形成的三維腫瘤球形態(tài)也不相同(圖2)，但當(dāng)腫瘤球直徑大于500 μm時，它們均具有以下基本結(jié)構(gòu)特性[8,16]。第一，腫瘤球產(chǎn)生梯度微環(huán)境，其內(nèi)部的氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、新陳代謝廢物和可溶性因子(細胞因子，生長因子和趨化因子)等物質(zhì)的擴散受阻，將引起腫瘤球從外到內(nèi)梯度升高的乏氧環(huán)境和代謝廢物堆積。內(nèi)部的乏氧環(huán)境進一步促進無氧糖酵解產(chǎn)物乳酸的堆積，導(dǎo)致腫瘤球具有從外到內(nèi)pH梯度降低的特征。第二，腫瘤球內(nèi)產(chǎn)生異質(zhì)細胞群體，由于新陳代謝廢物堆積和梯度微環(huán)境，在三維腫瘤球中細胞狀態(tài)也呈梯度變化，中心是壞死的細胞群，中間層是靜止期的細胞群，最外層是高增殖和易遷移的細胞群。第三，腫瘤球內(nèi)細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞不再貼壁或懸浮生長，而是與其他腫瘤細胞緊密接觸，此時細胞外基質(zhì)和細胞微絨毛等腫瘤固有結(jié)構(gòu)出現(xiàn)[17]。三維腫瘤球的以上基本特征和結(jié)構(gòu)特性使得三維腫瘤球細胞對藥物不敏感，產(chǎn)生耐藥性。

圖2 三維腫瘤球的形態(tài)特征和基本結(jié)構(gòu)特性

A：不同形態(tài)的腫瘤球;B：腫瘤球內(nèi)梯度的理化特性及其內(nèi)部細胞的異質(zhì)性

2 三維腫瘤球的耐藥機制

三維培養(yǎng)的腫瘤球具有體內(nèi)實體腫瘤組織的特點：細胞與細胞、細胞與胞外基質(zhì)之間的聯(lián)系增加；細胞異質(zhì)性增加；可以模擬體內(nèi)實體腫瘤微環(huán)境。研究表明，這些腫瘤球的特性致使腫瘤細胞的耐藥性增加，藥物的IC50增加(表2)。這種耐藥現(xiàn)象稱為多細胞耐藥(multicellular resistance MCR)[18]，這種耐藥的機制可以分為兩類，包括細胞之間“接觸效應(yīng)”導(dǎo)致的耐藥和模擬腫瘤微環(huán)境導(dǎo)致的耐藥。

表2 A549細胞在二維和三維培養(yǎng)條件下對不同藥物IC50(μmol/L)的比較

藥物IC50/(μmol/L)二維三維MCR指數(shù)順鉑3.0±0.581±1527阿霉素0.2±0.17±135依托泊苷3.2±0.3521±80163長春新堿0.008±0.00153±66 625

MCR指數(shù)是指三維細胞IC50/二維細胞IC50

2.1 細胞之間的“接觸效應(yīng)”

在三維培養(yǎng)條件下的細胞，即使腫瘤球體積很小(包含25～50個細胞)也表現(xiàn)出與二維細胞相比更加耐藥的現(xiàn)象[19]。Bates等[20]用單抗23C6(抗整合素)阻礙LIM 1863結(jié)腸癌細胞之間的接觸，與不加單抗培養(yǎng)成的三維腫瘤球相比，抗腫瘤藥物可以明顯提高加單抗培養(yǎng)的三維腫瘤球細胞的凋亡，結(jié)果說明，三維條件下細胞與細胞之間的相互接觸提高了細胞存活能力，這種現(xiàn)象即為細胞接觸介導(dǎo)的耐藥(cell adhesion-mediated drug resistance，CAM-DR)[21]。這種耐藥產(chǎn)生的原因主要有兩點：(1)細胞間連接增加，提高了細胞之間相互作用，進而增加細胞耐藥性；(2)細胞形態(tài)改變導(dǎo)致相關(guān)基因表達和染色體組壓縮程度改變，進而提高細胞自我修復(fù)能力(圖3)。

圖3 細胞之間“接觸效應(yīng)”對耐藥的影響[19]

2.1.1 三維腫瘤球增加細胞間連接和交流 Durand 等[22]發(fā)現(xiàn)三維腫瘤球提高了腫瘤細胞對藥物的耐受，并認為是由于受損腫瘤細胞周圍的腫瘤細胞可以通過細胞間連接，向受損細胞傳遞大量生物活性分子(修復(fù)酶、RNA、蛋白復(fù)合物等)，進而提高腫瘤細胞對藥物或輻射等損害的耐受性。事實上三維培養(yǎng)的細胞之間存在更加緊密的縫隙連接(gap junctions)、緊密連接(tight junctions)和細胞橋粒(desmosomes)[23]，這些細胞間連接增加了三維腫瘤球內(nèi)部細胞的交流。例如，Bai等[24]分別檢測了在三維和二維培養(yǎng)條件下，人肉瘤細胞HOSS1中細胞間隙連接蛋白(Cx26，Cx43和Cx45)的表達水平。免疫熒光染色結(jié)果顯示相比于二維細胞，在三維腫瘤球細胞中這些蛋白更加豐富。同時，RT-PCR和Western blot實驗同樣證實了這一結(jié)果，表明在三維培養(yǎng)條件下細胞間交流變得更加頻繁，相互影響更大。

另外，研究表明三維腫瘤球細胞中E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達量通常比二維細胞中多[15]。E-鈣黏蛋白是鈣離子依賴的細胞之間增強黏附的生物大分子，其表達量多少與細胞間連接緊密程度密切相關(guān)。而E-鈣黏蛋白表達增加會使p27Kip1蛋白的表達量上調(diào)，p27Kip1蛋白又是細胞周期依賴激酶的抑制蛋白，它的增加被證實可以抑制細胞周期進行，使更多細胞停留在G0/G1期，提高腫瘤細胞的耐藥性[25]。所以在三維腫瘤球中，腫瘤細胞間緊密連接促使E-鈣黏蛋白表達增加，進一步誘導(dǎo)了p27Kip1蛋白的上調(diào)，最終促進三維腫瘤球細胞耐藥性提高。

2.1.2 三維腫瘤球誘導(dǎo)細胞形態(tài)改變 三維環(huán)境中培養(yǎng)的細胞不僅具有特征性的生理和生物信號，影響細胞遷移、黏附、增殖等功能，而且每一個細胞及細胞核的形態(tài)與二維培養(yǎng)的細胞相比也會發(fā)生明顯改變，一般由二維培養(yǎng)時的不規(guī)則形變?yōu)榍蛐巍＜毎螒B(tài)在DNA復(fù)制、基因表達、細胞分化、DNA壓縮程度與修復(fù)能力中扮演重要角色。Folkman等[26]使用不同濃度的聚甲基丙烯酸羥乙酯(poly HEMA)來逐步降低細胞的黏附性，致使細胞形態(tài)梯度變化，poly HEMA濃度最低的一組細胞可形成腫瘤球。進一步對每個濃度梯度下細胞DNA復(fù)制進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)不同，其DNA復(fù)制速度和基因表達量均不相同。

同時，細胞形態(tài)直接影響細胞對藥物的敏感性。例如在對V79細胞進行電離輻射時發(fā)現(xiàn)，盡管大的腫瘤球(20～50個細胞)和小的腫瘤球(3～8個細胞)相比，細胞之間的交流頻率不同，但腫瘤細胞都呈現(xiàn)出球形的形態(tài)，且均表現(xiàn)出相同的電離輻射耐受性。進一步地通過吖啶橙染色、核酸沉淀和中性濾膜洗脫等實驗表明在三維腫瘤球細胞中DNA的構(gòu)象發(fā)生明顯改變，但具體的分子機制還有待進一步研究[27]。

2.2 微環(huán)境影響

2.2.1 三維腫瘤球的乏氧環(huán)境 與正常組織中氧含量相比，三維腫瘤球中存在乏氧環(huán)境，而腫瘤細胞在乏氧狀態(tài)下也表現(xiàn)出較高的耐藥性。研究表明乏氧環(huán)境引起的耐藥機制體現(xiàn)在多個方面。第一，乏氧區(qū)域細胞增殖較慢，導(dǎo)致腫瘤細胞對周期依賴性藥物的敏感度降低[28]；第二，腫瘤乏氧環(huán)境與抑癌蛋白p53的缺失密切相關(guān)，p53的缺失降低了細胞凋亡、增加了血管生成和侵襲[29]；第三，乏氧下調(diào)一些抗腫瘤藥物的靶點如DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的表達，進而使得靶向拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的藥物如依托泊苷的抗腫瘤活性降低[30]；第四，乏氧可以誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，增強腫瘤細胞在壓力下的生存能力[31]；第五，乏氧將誘導(dǎo)HIF-1α應(yīng)激蛋白的表達，從而激活其下游與細胞耐藥相關(guān)的一系列蛋白，如上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、外排泵蛋白(P-gp)、血管細胞生長因子(VEGF)，下調(diào)細胞周期蛋白D-1(cyclin D1)等[32]。其中，最重要的是抗凋亡蛋白Bcl-2的調(diào)節(jié)，它能抑制線粒體釋放細胞色素C誘導(dǎo)的細胞凋亡通路。研究表明腫瘤球細胞的乏氧會使Bcl-2蛋白家族上調(diào)，從而減少細胞凋亡。例如，Kim等[33]用U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和U87星形膠質(zhì)瘤細胞研究腫瘤球細胞在乏氧環(huán)境下對藥物耐受性的影響。結(jié)果顯示，在三維培養(yǎng)條件下，腫瘤細胞可以產(chǎn)生不同程度的耐藥現(xiàn)象，腫瘤細胞中與凋亡相關(guān)的蛋白表達水平發(fā)生很大的改變，例如，與細胞程序性死亡相關(guān)的蛋白激酶Caspase-3活性降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2和生存素(survivin)表達水平顯著上調(diào)。

除上述機制外，Qin等[34]研究維莫非尼(vemurafenib)治療黑色素瘤時發(fā)現(xiàn)，三維腫瘤球細胞和乏氧條件下培養(yǎng)的二維細胞，均比正常氧含量下的二維細胞更加耐藥。結(jié)果顯示，在三維腫瘤球細胞和乏氧二維細胞中磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸激酶(p-Akt)表達上調(diào)，HGF/c-Met通路中兩個蛋白：肝細胞生成因子(HGF)、細胞間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)換因子(c-Met)表達也同時上調(diào)。當(dāng)加入抗HGF單抗(anti-HGF antibodies)阻斷HGF激活HGF/Met通路后，p-Akt的表達水平隨之降低，表明Akt的磷酸化是由激活HGF/MET通路引起。進一步地聯(lián)合HGF/Met通路激活抑制劑MSC2156119J給藥后，可以顯著增強維莫非尼對三維腫瘤球細胞和乏氧二維細胞的殺傷效果，表明乏氧致使HGF/MET通路激活，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性。

2.2.2 三維腫瘤球的弱酸環(huán)境 三維腫瘤球內(nèi)部由于缺乏養(yǎng)分和氧氣，無法為腫瘤細胞提供生命活動所需的能量。因此，腫瘤細胞將上調(diào)丙酮酸激酶(M2-PK)表達，通過無氧糖酵解(glycolysis)的方式產(chǎn)生維持細胞生命活動的ATP。糖的無氧酵解在腫瘤細胞中產(chǎn)生大量乳酸(lactate)[35]，進而激活V-ATP酶、Na+/H+質(zhì)子交換泵、單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白和碳酸酐酶9，排出過多的H質(zhì)子[36]，在腫瘤細胞的周圍產(chǎn)生弱酸性的環(huán)境(pH約6.5～7.1)。相比于腫瘤細胞外部的弱酸環(huán)境，細胞內(nèi)依然保持弱堿性生理微環(huán)境(pH約7.4)，這種腫瘤微環(huán)境的獨特性質(zhì)被稱作“顛倒的pH梯度(reversed pH gradient)”[37]。

腫瘤弱酸性的微環(huán)境致使細胞膜內(nèi)葉(inner leaflet)磷脂之間的相互作用改變，細胞膜剛性增加[38]，造成抗腫瘤藥物在腫瘤細胞中的攝取量減少。另外，腫瘤細胞膜兩側(cè)梯度的pH環(huán)境促進腫瘤細胞P-糖蛋白與抗腫瘤藥物的相互結(jié)合，增加藥物的外排[39]。還有研究表明，即使藥物分子通過細胞膜，但細胞內(nèi)酸性細胞器如溶酶體和內(nèi)涵體與細胞質(zhì)pH相差較大，導(dǎo)致大部分弱堿性的抗腫瘤藥物停留在這些酸性細胞器內(nèi)，無法到達作用部位(細胞核)，進而提高腫瘤細胞的耐藥[40-41]。為了克服腫瘤微酸環(huán)境產(chǎn)生的耐藥性，Luciani等[42]首先采用細胞質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors PPI)奧美拉唑、埃索美拉唑或泮托拉唑抑制腫瘤細胞的微酸環(huán)境，然后再檢測抗腫瘤藥物對細胞的毒性。結(jié)果表明，經(jīng)過PPI處理的細胞對順鉑、氟尿嘧啶和長春新堿具有較高的敏感性，藥物的IC50降低99%，進一步證明微酸環(huán)境在腫瘤細胞耐藥機制中扮演重要作用。

2.2.3 三維腫瘤球中靜止期細胞增加 隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細胞突變(tumor mutations)和基因組重排(genomics rearrangements)會逐漸增加，這些改變往往會引發(fā)腫瘤細胞的耐藥性。三維腫瘤球內(nèi)細胞是高度異質(zhì)性的。例如，Pettersson等[43]對腫瘤球進行檢測時發(fā)現(xiàn)氚標記的胸苷標記指數(shù)(tritiated thymidine labelling index)從外圍到內(nèi)部迅速降低，在腫瘤球175 μm深處標記值接近于0，說明三維腫瘤球從外到內(nèi)，處于靜止期的腫瘤細胞逐漸增多。而處于靜止期的腫瘤細胞通常比分裂期細胞對藥物更加耐受，因此，三維腫瘤球細胞對抗腫瘤藥物展現(xiàn)出較強的耐藥性。Beaumont等[44]使用二維和三維腫瘤模型，考察細胞周期對臨床抗腫瘤藥物毒性的影響，他們分別用MEK抑制劑U0126和選擇性BRAF抑制劑PLX4032對細胞進行預(yù)處理，這兩種抑制劑均能阻滯腫瘤細胞在G1期[45]。然后觀察預(yù)處理細胞對硼替佐米和替莫唑胺的細胞存活率，結(jié)果顯示U0126和PLX4032均能提高細胞對藥物的耐受性。進一步用乏氧和饑餓條件處理細胞，模擬生理條件下誘導(dǎo)的G1期阻滯，結(jié)果同樣提高了細胞對抗腫瘤藥物的耐受性。同時，他們在檢測給藥后三維腫瘤球細胞周期的變化時，發(fā)現(xiàn)在給藥后期，只有腫瘤球內(nèi)部的G1期細胞存活較多，進一步證明靜止期細胞具有較強的耐藥性。

細胞周期進程中有兩個重要的周期檢查點(G1后期和即將進入M期前)控制著細胞凋亡的開始[46]。當(dāng)細胞周期進行到檢查點時，細胞不但可以進入周期下一階段，而且當(dāng)細胞受到損傷時也可以進入凋亡程序。影響細胞周期的兩個重要蛋白是細胞周期依賴蛋白(cyclin-dependent kinases，CDK)和細胞周期素(cyclins)，而它們的抑制劑(CDK inhibitors或CKIs)被認為實際調(diào)控著周期進程。該抑制劑有兩大家族p21家族(包括p21Cip1/Waf1，p27Kip1和p57Kip2)和INK4家族(包括p15INK4b，p16INK4a，p18INK4c和p19INK4d)，它們表達量的上升均使細胞周期發(fā)生阻滯[47]。其中，p27Kip1和p21Cip1/Waf1蛋白在腫瘤細胞耐藥機制中扮演著重要角色。研究表明[25，48]，p27Kip1和p21Cip1/Waf1蛋白在三維培養(yǎng)的細胞中表達量是二維細胞的15倍，即表明三維培養(yǎng)的腫瘤細胞中有更多的細胞被阻滯在G0/G1期。而且，當(dāng)進一步地使用siRNA降低p27Kip1表達量后，三維腫瘤球細胞之間的黏附隨之降低，增殖能力增強，對藥物的敏感性也增強，表明p27Kip1導(dǎo)致的細胞周期G1期阻滯是三維腫瘤球細胞耐藥的重要因素之一。

2.2.4 三維腫瘤球的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM) 不同于二維細胞，三維培養(yǎng)的腫瘤球細胞之間可以產(chǎn)生ECM，而且不同種類的腫瘤細胞產(chǎn)生ECM的量及其組成有很大差別，產(chǎn)生的ECM在腫瘤細胞的遷徙及其對藥物的敏感性方面起著重要作用。Bai等[24]證實了與ECM組成密切相關(guān)的蛋白(COL1A1、LOX、FN1、SNED1、ITGB1和LAMA4)在三維細胞中的表達水平明顯高于二維細胞。而且，一些與ECM相關(guān)的蛋白如SNED1已被報道與細胞的耐藥密切相關(guān)[49]。

此外，有研究表明，由整合素和鈣黏素介導(dǎo)的細胞與ECM的相互作用可以激活Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt通路，導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥增加[15]。再者，Sethi等[50]在研究非小細胞肺癌細胞的耐藥時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞在纖鏈蛋白fibronectin (Fn)、層粘連蛋白laminin (Ln)、膠原Ⅳ(collagen IV)或固生蛋白(tenascin)等ECM上黏附生長時，腫瘤細胞的增長數(shù)量明顯增加[50]。當(dāng)給予腫瘤細胞相同濃度抗腫瘤藥物依托泊苷時，ECM黏附的細胞凋亡率比沒有ECM黏附的細胞凋亡率低80%。但是如果將ECM換成聚L-賴氨酸時，ECM抑制凋亡的效果就不存在。進一步對ECM抑制凋亡的機制探討發(fā)現(xiàn)，整合素β1單抗P5D2(阻斷ECM與整合素β1的結(jié)合)可以阻止ECM介導(dǎo)的凋亡保護。另外，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，tyrphostin-25(一種蛋白酪氨酸激酶PTK抑制劑)同樣可以阻止ECM對凋亡的保護作用，但沒有阻礙細胞與ECM的黏附。以上研究表明，ECM介導(dǎo)的細胞耐藥，是通過激活整合素β1進而激活PTK通路，進而增加腫瘤細胞的耐藥，進一步揭示了ECM在腫瘤細胞耐藥中發(fā)揮重要作用。

3 結(jié)語與展望

三維腫瘤球模型能夠?qū)⒛[瘤細胞、細胞外基質(zhì)以及其他生物分子整合在一起，真實地模擬腫瘤生長和進展的微環(huán)境，最大程度地維持腫瘤細胞的活性功能，更有利于腫瘤學(xué)特別是腫瘤耐藥機制方面的研究。因此，本文通過分析三維腫瘤球的結(jié)構(gòu)特征，有效地從三維腫瘤球形態(tài)及微環(huán)境兩個方面系統(tǒng)總結(jié)三維腫瘤球產(chǎn)生耐藥的原因，具有極大的研究意義和臨床價值。然而，揭示腫瘤細胞耐藥機制后，需要開發(fā)新的技術(shù)和手段克服腫瘤細胞耐藥，提高對腫瘤的治療效果，這些將是下一階段腫瘤治療研究的主要方向之一。另外，現(xiàn)階段的三維腫瘤球培養(yǎng)技術(shù)仍存在無法保證每個腫瘤球的大小、所包含細胞數(shù)量、緊密度等指標完全相同[51]，缺乏參考標準和產(chǎn)出數(shù)量有限等問題，所以完善培養(yǎng)方法和建立評價標準亦是今后需要攻克的一個難題。最后，隨著三維腫瘤球技術(shù)的進步發(fā)展，腫瘤球的組成將越來越復(fù)雜，需要生物、化學(xué)、工程等多種學(xué)科共同協(xié)作開發(fā)出更先進的三維腫瘤模型，促進新型臨床醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展。