梁 喬，楊本勇，石 霖，李井春，張 健，趙鳳菊?

（1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110164）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）是常規(guī)豬上呼吸道的共存菌，在特定條件下，能夠引起纖維素性心包炎、腦膜炎、急性敗血癥等疾病[1-2]。該菌主要的感染對象是斷奶前后仔豬和保育豬，具有較高的發(fā)病率和死亡率[3-4]。呼吸道疾病的危害性日趨顯著，尤其是引起的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎等危害性疾病嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展[5]，因此，早期檢測尤為重要，本試驗(yàn)通過對副豬嗜血桿菌的保守基因infB序列設(shè)計(jì)引物，建立了該病原菌的PCR檢測方法，為該病的防控和研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 副豬嗜血桿菌由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌、奇異變性桿菌、豬鏈球菌由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存。

1.1.2 主要試劑DNAzol購自invitrogen公司；EX Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP（2.5 mmol/L)、溴化乙錠、DL 2000 DNA Marker、三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液購自寶生物工程（大連）有限公司；犢牛血清購自澳洲Gibico；TSA購自北京奧博星公司；輔酶I（NAD煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 引物 根據(jù)副豬嗜血桿菌infB基因序列設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，根據(jù)GenBenk公布的國內(nèi)外副豬嗜血桿菌infB基因的參考序列合成1對引物分別為：DQ781933、EF396317、HM243068、KT740926，引物序列見表1。

表1 infB基因PCR引物Table 1Design of PCR primers for HPS

1.2 方法

1.2.1 DNA模板的制備 取保存的副豬嗜血桿菌菌種接種于加有血清的TSA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24 h后，挑選典型菌落，用滅菌生理鹽水制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，按DNAzol提取試劑說明書進(jìn)行DNA的提取，將提取的DNA置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 infB基因的PCR反應(yīng)及條件 采用25 μL反應(yīng)體系：滅菌去離子水15.375 μL；10×PCR緩沖液 2.5 μL；dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L）2 μL；EX Taq DNA聚合酶0.125 μL；上、下游特異性PCR引物各1 μL；DNA 2 μL。反應(yīng)條件為 ：94℃3 min，94℃30 s，49℃30 s，72℃50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 將副豬嗜血桿菌和金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌、奇異變性桿菌、豬鏈球菌在優(yōu)化后的體系和條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并設(shè)立陰性對照。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 將副豬嗜血桿菌DNA進(jìn)行10倍倍比稀釋5個(gè)梯度后，進(jìn)行擴(kuò)增來檢測該方法的敏感性。

1.2.5 臨床應(yīng)用 用本試驗(yàn)建立的副豬嗜血桿菌PCR檢測方法對10份臨床樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)設(shè)立陽性病料對照、無模板陰性對照，并選取6份副豬嗜血桿菌陽性樣品擴(kuò)增其infB序列，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，并與NCBI基因庫進(jìn)行序列同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 副豬嗜血桿菌PCR擴(kuò)增結(jié)果 以副豬嗜血桿菌的DNA為模板，利用本試驗(yàn)建立的方法進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，PCR可擴(kuò)增出目的條帶，無模板陰性對照無目的條帶（見圖1）。

圖1 副豬嗜血桿菌PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1PCR amplification results of Haemophilus accessory swine Haemophilus

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果及退火溫度的優(yōu)化Fig.2PCR amplification results and Optimization of annealing temperature

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果及退火溫度的優(yōu)化 對PCR退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，不同退火溫度對擴(kuò)增結(jié)果影響不大，最終選擇49℃作為PCR最佳退火溫度（見圖2）。

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對副豬嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、豬鏈球菌及陰性對照進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，均未擴(kuò)增出條帶，而副豬嗜血桿菌可見清晰的目的條帶（見圖3）。

圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The specificity test results

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，敏感性達(dá)到10-6倍稀釋度，最低檢出量分別為18.1×10-6μg/mL（見圖4）。

圖4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4The sensitivity test results

2.5 部分臨床樣品檢測結(jié)果 應(yīng)用建立的方法對10份臨床樣品疑似病料進(jìn)行檢測，6份為副豬嗜血桿菌陽性，4份為副豬嗜血桿菌陰性。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后與GenBank中收錄的副豬嗜血桿菌infB基因參考序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，6份陽性樣品經(jīng)測序比對后的基因序列核苷酸同源性為98.2%～99%范圍內(nèi)，說明該方法能準(zhǔn)確地檢測出病料中的副豬嗜血桿菌。

圖5 部分臨床樣品檢測結(jié)果Fig.5Test results of some clinical samples

3 討論

本試驗(yàn)建立的副豬嗜血桿菌PCR檢測方法能夠擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的目的基因條帶，且對其他5種細(xì)菌均無擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生，表明建立的PCR方法具有較高的特異性。通過敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在菌懸液濃度為18.1×10-6μg/mL時(shí)，能夠擴(kuò)增出清晰的目的條帶，說明該方法具有較好的敏感性，通過臨床樣品的檢測，說明該方法能用于檢測臨床病料的檢測。

副豬嗜血桿菌作為一種呼吸道傳染病嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)，也成為世界范圍內(nèi)導(dǎo)致保育仔豬死亡的一種典型的細(xì)菌性疾病，能夠引起豬的全身性感染，如多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、支氣管肺炎等[6]。副豬嗜血桿菌病常常與豬繁殖呼吸綜合征、圓環(huán)病毒病等免疫抑制性疾病發(fā)生混合感染，單純靠臨床癥狀無法確診該病[7]。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定存在耗時(shí)長、不易于保存等特點(diǎn)[8-10]，本試驗(yàn)建立的PCR的檢測方法不僅為副豬嗜血桿菌病的診斷提供的技術(shù)支撐，也為多發(fā)性漿膜炎、傳染性胸膜肺炎等的有效防控提供了理論依據(jù)。