劉艷霞

（遼寧益康生物股份有限公司，遼寧 遼陽 111000）

狂犬病（Rabies）是由狂犬病毒感染引起的一種致死性、人獸共患的傳染病，表現(xiàn)為急性、進行性、幾乎不可逆轉(zhuǎn)的腦脊髓炎，臨床表現(xiàn)恐水、怕風(fēng)、興奮、咽肌痙攣、流涎、進行性癱瘓等癥狀，最后因呼吸、循環(huán)衰竭而死亡[1]。犬狂犬病在80多個國家和地區(qū)廣泛分布，主要是發(fā)展中國家。99%以上的人狂犬病病例的病毒都來自于犬[2]。通過大幅度提高犬的免疫覆蓋率，在控制了犬狂犬病流行的同時也使人狂犬病的發(fā)病率顯著降低[3-4]?？袢∪醵净钜呙绲陌踩砸恢绷钊藫?dān)憂[5]，2017年7月1日，農(nóng)業(yè)部發(fā)布第2514號公告，停止生產(chǎn)使用狂犬病活疫苗（包括多聯(lián)活疫苗）。目前國內(nèi)市場上獸用狂犬病滅活疫苗毒株主要為FluryLEP株、Flury株、PV206株、CVS-11株、CNT-1株、SAD株、dG株、PV/BHK-21株，其中絕大多數(shù)采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝進行生產(chǎn)。高滴度的抗原液是疫苗生產(chǎn)中非常重要的一個環(huán)節(jié)。本試驗利用臺灣TideCell-010型生物反應(yīng)器，采用BioNOCTMⅡ型微載體培養(yǎng)BHK-21細胞繁殖狂犬病毒Flury株，提高抗原液的病毒滴度，降低成本，為制備高品質(zhì)的獸用狂犬病滅活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 細胞 BHK-21細胞由美國典型菌種保藏中心（ATCC）引入，由遼寧益康生物股份有限公司對BHK-21細胞系進行建庫和檢驗，符合生產(chǎn)標準。

1.2 毒種 狂犬病病毒Flury株，由遼寧益康生物股份有限公司鑒定、保管和供應(yīng)。

1.3 主要儀器和試劑Tide Cell-010型高密度細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器（潮汐式曝氣式，載體床型）、葡萄糖濃度測試計、BioNOCTMⅡ型微載體、葡萄糖濃度測試芯片均購至賽宇細胞科技股份有限公司；細胞計數(shù)儀購至上海睿鈺生物IC1000；新生牛血清為內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；DMEM高糖細胞培養(yǎng)基為Gibco；細胞生長液為8%FCS DMEM；細胞維持液為2%FCS DMEM等。

2 試驗方法

2.1 Tide-Cell培養(yǎng)BHK-21細胞條件優(yōu)化和工藝的確定 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)BHK-21細胞形成致密單層，胰酶消化、回收細胞，得到種子細胞混懸液。通過對混懸液內(nèi)的細胞計數(shù)，進行了三批次的種細胞不同初始接種數(shù)量試驗，起始細胞總數(shù)分別接入5×109個cells、10×109個cells及20×109個cells。將種子細胞接入含有500 g的BioNOCⅡ型微載體的10 L載體瓶內(nèi)，在37℃條件下開始吸附，經(jīng)過3 h的吸附，液位上下浮動為1 L的流動體積，液面的上滯留時間為2 min，液位下滯留時間為30 s，以使細胞與載體能夠充分接觸，增強吸附效果。吸附結(jié)束后，進入細胞培養(yǎng)程序，控制培養(yǎng)液溶氧達到30%以上，pH穩(wěn)定在7.2～7.4。由于BHK-21細胞代謝較強，液位上下浮動為8 L的流動體積，流速為3 500 mL/min，液面的上滯留時間為1.5 min，液位下滯留時間為30 s，為細胞生長提供一個舒適的培養(yǎng)環(huán)境，采用連續(xù)批次換液方式培養(yǎng)BHK-21細胞，生長液的pH值穩(wěn)定在7.2～7.4。細胞在生物反應(yīng)器上培養(yǎng)120 h后，無菌條件下采集載體樣品，結(jié)晶紫細胞核計數(shù)方法，用細胞計數(shù)儀計數(shù)。每間隔24 h，取培養(yǎng)液樣品并測定殘余葡萄糖含量，通過載體內(nèi)細胞對葡萄糖的消耗量評價細胞生長狀況及數(shù)量。

2.2 Tide-Cell培養(yǎng)Flury株病毒的接毒量優(yōu)化 細胞培養(yǎng)使用連續(xù)批次換液方式，Tide-Cell培養(yǎng)BHK-21細胞120 h后，葡萄糖消耗量約為8 g/（L·h），此時細胞活性較好，為最佳接毒時機。參考平面培養(yǎng)Flruy株的最適接毒量和MOI，選用MOI分為0.2、1和2（三次試驗）的3個不同感染復(fù)數(shù)，含有以上病毒量的8 L細胞維持液接入已排空細胞生長液的載體罐內(nèi)，靜止細胞吸附病毒1 h后，開始病毒培養(yǎng)，間隔24 h采樣，用直接免疫熒光法測定樣品TCID50毒價（按Reed-Muench法計算）。了解病毒增殖情況，通過病毒培養(yǎng)曲線確定最佳MOI。

2.3 Tide-cell培養(yǎng)Flury株病毒培養(yǎng)條件及收獲抗原液時間的優(yōu)化 將4～5代狂犬病病毒Flury株按照合適比例（最佳MOI）接入載體瓶內(nèi)，靜止吸附1 h。開始病毒培養(yǎng)后，補加維持液至50 L，間隔24 h采樣測定毒價和收獲抗原液50 L后，補加相同量的新病毒維持液，并且按照此方法連續(xù)收獲抗原液，直到抗原液毒價低于107.5TCID50/mL為止。通過掌握狂犬病病毒在生物反應(yīng)器的增殖曲線，以確定最佳收獲病毒抗原時間。通過連續(xù)重復(fù)3個批次Tide-Cell狂犬病滅活疫苗抗原培養(yǎng)，進一步完善工藝。

3 結(jié)果與分析

3.1 Tide-Cell培養(yǎng)BHK-21細胞條件優(yōu)化和工藝的確定 結(jié)果說明生物反應(yīng)器Tide-Cell培養(yǎng)BHK-21細胞吸附程序和培養(yǎng)程序，連續(xù)批次換液方式均合適。接種的細胞數(shù)為10×109個和20×109個培養(yǎng)120 h細胞總數(shù)無明顯差異，而接種的細胞數(shù)為5×109個表現(xiàn)出細胞數(shù)量偏少。同時，培養(yǎng)液葡萄糖含量測定結(jié)果也表明，細胞對其消耗量與細胞數(shù)量具有一定正相關(guān)性。

BHK-21細胞充分利用了三維立體結(jié)構(gòu)的BioNOCⅡ微載體，與二維平面細基質(zhì)相比表現(xiàn)出了非常大的優(yōu)勢，細胞生長狀況見圖1和圖2。

3.2 Tide-Cell培養(yǎng)Flury株病毒接毒量優(yōu)化 在Tide-Cell生物反應(yīng)器上每一批次總計進行了12 d的病毒培養(yǎng)，接毒量MOI為1或者2時，接毒后48 h，病毒毒價即達到107.5TCID50/mL以上，此時開始收獲合格的病毒抗原液。第二批MOI為1的病毒增殖出現(xiàn)毒價高峰是在接毒96 h后，毒價為109.0TCID50/mL，明顯高于第一批MOI為0.2和第三批次MOI為2的108.3TCID50/mL和108.5TCID50/mL。從病毒高峰持續(xù)時間分析，第二批次病毒總體評價毒價也高于其他兩個批次，因此試驗結(jié)果表明最佳感染復(fù)數(shù)MOI為1，見圖3。

表1 反應(yīng)器微載體接入不同初始量的BHK-21細胞的培養(yǎng)結(jié)果Table 1The cell culture result of Bioreactor microcarrier culturing BHK-21 cells inoculated with different amount of cells

圖1 平面培養(yǎng)BHK-21細胞Fig.1BHK-21cell culture on plate

圖2 BioNOC II載體培養(yǎng)BHK-21細胞Fig.2BioNOC II Microcarrier culture

3.3 生物反應(yīng)器Tide-Cell培養(yǎng)狂犬病病毒Flury株抗原液 通過連續(xù)重復(fù)相同培養(yǎng)條件的3個批次試驗，可以確定接毒量MOI為1時，病毒培養(yǎng)48 h后，病毒抗原液毒價高于107.5TCID50/mL，開始收獲合格的病毒抗原液，一般每批次至少收獲10次毒價高于107.5TCID50/mL抗原液（每次50 L）。在收獲的抗原液里，病毒毒價最高達到109.3TCID50/mL高于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝培養(yǎng)的15倍以上，且連續(xù)收獲毒價高于108.0TCID50/mL的收次高于5次，極大地提高了傳統(tǒng)工藝培養(yǎng)病毒毒價及總體產(chǎn)能，見圖4。

圖4 三批次狂犬病Flury株病毒培養(yǎng)曲線Fig.4 Three batch of Rabies virus proliferation curves

本工藝研究試驗，至少含有1×1010個細胞的生長液接入Tide-Cell培養(yǎng)系統(tǒng)載體瓶內(nèi)，設(shè)定參數(shù)，進入細胞吸附載體培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)使用連續(xù)的批次換液方式，總體pH值控制在7.2～7.4，DO在30%以上。在培養(yǎng)期間，一般間隔24 h采樣，測定葡萄糖殘留量，同時也通過計算糖的消耗量來評估監(jiān)測細胞生長狀況。當(dāng)細胞培養(yǎng)約為120 h，葡萄糖消耗量達到8 g/（L·h）附近時，細胞數(shù)達到4×1011個，按照MOI為1接入Flury株種毒，靜止吸附1h后開始病毒培養(yǎng)。病毒培養(yǎng)過程pH控制在7.4～7.5，DO在30%以上。使用細胞維持液量滿足細胞培養(yǎng)病毒需要，并能對維持液內(nèi)完整的病毒顆粒保護。一般至少可以收獲10次毒價高于107.5TCID50/mL的抗原液，包含5收次毒價為108.0TCID50/mL的抗原液。

4 討論

通過這三批次試驗，為生物反應(yīng)器培養(yǎng)狂犬病抗原培養(yǎng)工藝累積了寶貴的試驗數(shù)據(jù)，能夠為實現(xiàn)將來的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。Tide-Cell培養(yǎng)系統(tǒng)500 g BioNOCⅡ型微載體培養(yǎng)BHK-21細胞倍增速度和時間與王進產(chǎn)等[6]、譙小燕等[7]微載體培養(yǎng)BHK-21細胞密度略具優(yōu)勢。Tide-Cell生物反應(yīng)器培養(yǎng)BHK-21細胞生產(chǎn)的高毒價狂犬病病毒抗原，使狂犬病病毒的毒價由在轉(zhuǎn)瓶細胞上培養(yǎng)時的107.5TCID50/mL上升至最高的109.0TCID50/mL，提高了31倍。Tide-cell系統(tǒng)每一批次能收抗原液50 L，最少收獲10次，總計相當(dāng)于500～800個以上轉(zhuǎn)瓶的產(chǎn)能，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝相比降低了成本。同時，降低了轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過程批次間差異大，培養(yǎng)過程無法精確控制的缺點，有利于下游的濃縮和純化工藝，提高了狂犬病滅活疫苗的質(zhì)量。動物細胞微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)市目前最具發(fā)展前途的細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)之一，在未來生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景不可估量[8]。