王 迅 鄒愷平 周琴妹 張 源

（南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇南京210029）

小兒退熱合劑為江蘇省中醫(yī)院兒科用藥，由荊芥、防風、黃柏、鉤藤、大黃等中藥組成，功效辛涼解表、祛風退熱，用于上呼吸道感染、流行性感冒之發(fā)熱癥[1-2]，作為江蘇省中醫(yī)院特色醫(yī)療機構制劑，臨床療效十分顯著。為進一步提高制劑的質量標準和穩(wěn)定性，本實驗在小兒退熱合劑原質量標準的基礎上，對方中黃柏和鉤藤進行了薄層定性鑒別研究，并對大黃中5種蒽醌類成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進行了含量測定研究，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料

1.1 藥材與試劑 黃柏對照藥材（批號：121510-201105），鹽 酸 黃 柏 堿 對 照品（批號：111895-201202），異構藤堿對照品（批號：111927-201102），蘆薈大黃素對照品（批號：110795-201007），大黃酸對照品（批號：110757-200206），大黃素對照品（批號：110756-200110），大黃酚對照品（批號：110796-201118），大黃素甲醚對照品（批號：110758-201013），均購自中國食品藥品檢定研究院。荊芥（批號：140202），防風（批號：131016），黃柏（批號：131122），石膏（批號：131210），鉤藤（批號：140225），薄荷（批號：140312），大黃（批號：131116），以上飲片均購自南京松齡中藥飲片有限公司。小兒退熱合劑（批號：1601001、1601002、1601003），由江蘇省中醫(yī)院制劑部生產(chǎn)。

1.2 主要儀器 高效液相色譜儀（1260S型，美國Agilent公司）；凝膠成像分析儀（型號WD-9413A，北京市六一儀器廠）；電熱恒溫鼓風干燥箱（型號DHG-9123A，上海精宏實驗設備儀器廠）；醫(yī)用超聲波清洗儀（型號KQ-1000E，昆山市超聲儀器有限公司）；萬分之一電子天平（AX224ZH/E，美國OHAUS Corp）；十萬分之一電子天平（AR2140型，美國OHAUS Corp）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃柏的薄層鑒別 供試品溶液制備：取小兒退熱合劑10mL，蒸干，加1%醋酸甲醇溶液50mL，于60℃超聲處理20min，濾過，濾液濃縮至2mL作為供試品溶液。陰性供試品溶液制備：制備不含黃柏的小兒退熱合劑，同供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。對照品溶液制備：取鹽酸黃柏堿對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液作為對照品溶液。對照藥材溶液制備：取黃柏對照藥材0.1g，加1%醋酸甲醇20mL于60℃超聲處理20min，濾過，濾液濃縮至2mL作為對照藥材溶液。按照薄層色譜法試驗，吸取上述4種試液各3～5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶4）的下層溶液為展開劑，置于氨蒸汽飽和展開缸展開，取出，晾干，噴稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，結果見圖1。

2.1.2 黃柏鑒別方法的耐用性考察 取上述供試品溶液、對照品溶液各5μL，分別同時點于兩硅膠板上，按建立的薄層鑒別條件，分別在溫度10℃、濕度32%和溫度35℃、濕度72%條件下展開，取出，晾干，顯色。結果顯示，分離度較好，重現(xiàn)性好，見圖1。

2.1.3 鉤藤的薄層鑒別 供試品溶液制備：取小兒退熱合劑30mL，加濃氨試液15mL和三氯甲烷50mL，加熱回流2h，放冷靜置，取三氯甲烷層，水浴蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，即得。陰性供試品溶液制備：制備不含鉤藤的小兒退熱合劑，同供試品溶液制備方法制得陰性供試品溶液。對照品溶液制備：取異鉤藤堿對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液作為對照品溶液。按照薄層色譜法試驗，吸取供試品及陰性供試品溶液各10～30μL，對照品溶液5μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-丙酮（6∶4）為展開劑，展開，取出，晾干，噴稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，結果見圖2。

2.1.4 鉤藤鑒別方法的耐用性考察 取上述供試品溶液15μL、對照品溶液5μL，分別同時點于兩硅膠板上，按建立的薄層鑒別條件，分別在溫度10℃、濕度32%和溫度35℃、濕度72%條件下展開，取出，晾干，顯色。結果顯示，分離度較好，重現(xiàn)性好，見圖2。

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含蘆薈大黃素352.9μg、大黃酸728.8μg、大黃素324.2μg、大黃酚484.7μg，大黃素甲醚109.3μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液與陰性供試品溶液制備 取本品1mL置具塞錐形瓶中，加8%鹽酸溶液10mL，超聲（功率280W，頻率50kHz）10min，加入三氯甲烷10mL，加熱回流1h，放冷，轉移至分液漏斗，再加三氯甲烷10mL，振搖提取3次，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。同法制備陰性樣品。

2.2.3 色譜條件及專屬性考察 色譜柱：Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（83∶17）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL；檢測波長：254nm。結果見圖3，被測成分色譜峰分離度良好，陰性無干擾。

2.2.4 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液適量，制成含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的濃度分別為35.29、72.88、32.42、48.47、10.93μg/mL的混合對照品溶液，依次稀釋2、4、8、16、32倍。精密吸取上述溶液10μL，按照“2.2.3”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積。以峰面積值為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，得5種對照品的線性回歸方程，結果見表1。

2.2.5 精密度考察 精密吸取“2.2.4”項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，計算5種成分對照品的RSD分 別 為0.13%、0.20%、0.48%、0.24%、0.79%，RSD均小于5%，結果表明儀器精密度良好。

圖1 小兒退熱合劑黃柏鑒別及溫濕度耐用性薄層圖譜

圖2 小兒退熱合劑鉤藤的鑒別及溫濕度耐用性薄層圖譜

圖3 HPLC色譜圖

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進樣，測定峰面積值。結果顯示5種成分的RSD分別為1.16%、1.00%、1.86%、1.42%、1.96%，均小于5%，結果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定良好。

2.2.7 重復性考察 精密吸取同一批號（1601001）樣品1mL，共6份，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法進行制備，進樣，測定峰面積值。結果顯示5種成分的RSD分 別為0.91%、0.73%、0.77%、0.38%、1.09%，表明重復性良好。

2.2.8 加樣回收試驗 精密吸取已知含量的樣品（批號1601001）1mL，共6份，精密加入一定量的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法進行制備，進樣，測定峰面積值，計算，結果見表2。

2.2.9 3批樣品含量測定 取3批樣品，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法進行制備，測定，計算，結果見表3。

3 討論

3.1 定性鑒別 小兒退熱合劑的原標準中僅有理化鑒別項，本研究參考藥典及文獻的方法，對小兒退熱合劑中的黃柏和鉤藤進行了薄層定性鑒別研究[3-4]。實驗所得到的薄層色譜圖斑點清晰，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性未見干擾。在此基

礎上，本研究還對兩種方法進行了不同溫濕度的耐用性考察，結果顯示方法的重現(xiàn)性好。因此，可以考慮將上述薄層定性鑒別方法列入質量標準。

本實驗在薄層鑒別的過程中考察了不同點樣量及不同對照品（化學對照品和對照藥材）在薄層色譜圖上的效果，最終選擇了相對合適的點樣量和對照品進行實驗。

3.2 含量測定 本研究的含量測定選用小兒退熱合劑中大黃的5種蒽醌類成分作為指標成分，實驗中考察了不同有機相（甲醇和乙腈）以及不同比例的流動相的分離效果[5-7]，最終選擇了甲醇-0.1%磷酸溶液（83∶17）的流動相比例，該條件下各峰分離度良好，且在較短時間內(nèi)（30min）全部出峰，可以較好地進行測定。

表1 大黃中5種成分的線性關系表

表2 5種成分加樣回收率

表3 3批樣品中5種成分的含量測定 μg/mL

綜上所述，本實驗在小兒退熱合劑原質量標準基礎上建立了黃柏和鉤藤的薄層色譜鑒別方法及大黃中5種蒽醌類成分的HPLC含量測定方法。建立的方法經(jīng)3批樣品驗證考察，專屬性強，陰性無干擾，靈敏度高，重現(xiàn)性好。今后的研究將進一步建立黃柏、鉤藤等飲片成分同時測定的方法，可以更科學、更合理、更全面地進行質量評價。