王大瑋 保云瑩 唐紅燕 段安安 蔡年輝 許玉蘭 周 軍 李思廣

(1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2. 云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650224；3. 普洱市林業(yè)科學(xué)研究所，云南 普洱 665099；4. 云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201)

思茅松 (Pinuskesiyavar.langbianensis) 是我國(guó)云南省特有樹(shù)種，是優(yōu)良的家具用材及紙漿原料，同時(shí)還是我國(guó)重要的松脂資源[1]。目前思茅松已成為滇南地區(qū)人工造林的主要樹(shù)種，在林業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中占有重要地位[2]。

SSR (single sequence repeats) 分子標(biāo)記技術(shù)憑借其共顯性、多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于林木遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析等研究中[3-4]。思茅松的遺傳基礎(chǔ)研究比較薄弱，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，思茅松的RAPD、ISSR、AFLP等分子標(biāo)記反應(yīng)體系已經(jīng)逐步建立[5-8]，但至今尚未見(jiàn)有關(guān)SSR標(biāo)記反應(yīng)體系的報(bào)道。本研究的目的在于利用正交設(shè)計(jì)對(duì)思茅松的SSR-PCR反應(yīng)體系的各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上建立一套適合思茅松的SSR-PCR反應(yīng)體系，為思茅松遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

研究材料為構(gòu)建思茅松遺傳連鎖圖譜作圖群體的11個(gè)雜交親本 (優(yōu)良單株或無(wú)性系)，分別為：JG1、JG7、PW2、PW3、PW12、ZY1、JD5、NR7、SM11、LC3、LC9號(hào)。采集其幼嫩松針，-20 ℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA的提取和檢測(cè)

采用改良的CTAB法對(duì)思茅松基因組DNA進(jìn)行提取[8]。提取完成后，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，再用核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)其濃度及純度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

思茅松SSR-PCR反應(yīng)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 思茅松SSR-PCR反應(yīng)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(45)Table 1 SSR-PCR orthogonal design L16(45) of P.kesiya var. langbianensis

為了確定思茅松SSR-PCR反應(yīng)最佳體系，以JG1號(hào)基因組DNA作為模板。正交實(shí)驗(yàn)所用引物組合由Thao等[9]開(kāi)發(fā)，上游序列為：ACACACAA-AACCTTTTATAGGCAT；下游序列為：ATCGTTCTA-ATTGTCGCATATCGG。

針對(duì)模板Mg2+、DNA、引物、TaqDNA聚合酶、d NTPs 5種因素進(jìn)行L16(45) 正交實(shí)驗(yàn)，共16個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)2次。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

利用11個(gè)雜交親本的DNA作為模板進(jìn)行SSR擴(kuò)增，對(duì)優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測(cè)

8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 (圖1) 表明，各泳道主帶清晰，點(diǎn)樣孔無(wú)滯留物亮點(diǎn)出現(xiàn)。核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定結(jié)果表明，所有個(gè)體DNA的OD260/OD280值為1.8～2.0，濃度為100～200 ng/μL。因此，采用改進(jìn)的CTAB提取的思茅松基因組DNA質(zhì)量和純度均較高，蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)去除徹底。

圖1基因組DNA提取結(jié)果
Fig.1 Result of DNA extraction

2.2 正交實(shí)驗(yàn)各因子對(duì)結(jié)果的影響

16個(gè)處理由于5個(gè)因素濃度組合不同，擴(kuò)增結(jié)果有著比較明顯的差異 (圖2)。除第1、2、5、6 組合由于各因素濃度太低擴(kuò)增條帶較弱外，其余12個(gè)處理均能擴(kuò)增出條帶。其中第12組合擴(kuò)增效果最好，其擴(kuò)增條帶清晰，主帶明顯，在3次重復(fù)中表現(xiàn)穩(wěn)定，可以確定為最佳組合。

思茅松最佳SSR-PCR反應(yīng)體系為：在25 μL體系中，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，模板DNA濃度為60 ng，引物濃度為0.50 μmol/L，TaqDNA聚合酶用量為0.25 U，dNTP濃度為0.20 mmol/L。

M為marker，1～16為試驗(yàn)號(hào)。

圖2SSR-PCR正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Fig.2 Result of orthogonal design for SSR-PCR

2.3 SSR最佳反應(yīng)體系驗(yàn)證

利用優(yōu)化的思茅松SSR-PCR反應(yīng)體系，以11個(gè)雜交親本的DNA作為模板進(jìn)行SSR擴(kuò)增 (圖3)。結(jié)果表明，擴(kuò)增條帶清晰，有豐富的多態(tài)性，且穩(wěn)定性高。說(shuō)明優(yōu)化的思茅松SSR-PCR反應(yīng)體系可應(yīng)用于后續(xù)的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性等研究。

圖311個(gè)雜交親本的SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.3 SSR-PCR products of 11 hybrid parents

3 結(jié)論與討論

穩(wěn)定的SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化是SSR標(biāo)記后續(xù)應(yīng)用的基礎(chǔ)[10]。建立一個(gè)各因素濃度最合適的PCR 反應(yīng)體系是SSR 標(biāo)記在林木遺傳育種研究應(yīng)用中的基本條件之一[11]。所以為了后續(xù)思茅松遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性研究工作的順利開(kāi)展，一套優(yōu)化的思茅松SSR-PCR反應(yīng)體系必須建立。

本研究結(jié)果與2個(gè)云南松SSR-PCR反應(yīng)體系[12-13]相比，模板DNA用量和引物濃度均高于云南松反應(yīng)體系，其中DNA用量分別為60 ng和30 ng，用量相差了1倍；引物濃度分別為0.50和0.20 μmol/L，相差了2.5倍；但TaqDNA聚合酶用量又低于云南松體系，分別為0.25 U和1 U，相差了4倍，并且在2個(gè)云南松SSR-PCR反應(yīng)體系中dNTP和Mg2+2個(gè)影響因子的用量也不同。說(shuō)明SSR-PCR反應(yīng)體系得到的擴(kuò)增條帶是多因子綜合作用的結(jié)果[14]，在不同樹(shù)種中，各因子對(duì)PCR 結(jié)果的影響作用不同[15]，其最佳反應(yīng)體系也不同，即使同一植物，不同科研人員得出的結(jié)果也不會(huì)完全相同[16-17]。

目前，SSR-PCR體系建立的主要有單因子、完全及正交3種試驗(yàn)方法[18]，相比較而言，多因素正交實(shí)驗(yàn)是優(yōu)化SSR-PCR反應(yīng)體系的一種有效方法[19-20]。本研究通過(guò)L16(45) 正交實(shí)驗(yàn)對(duì)思茅松SSR-PCR反應(yīng)體系中的各因素進(jìn)行優(yōu)化，得到了一套能夠穩(wěn)定擴(kuò)增且能重復(fù)利用的反應(yīng)體系，為今后的遺傳多樣性分析及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等研究提供了有力的支持。