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(1 塔里木大學生命科學學院， 新疆 阿拉爾 8433003)(2 塔里木大學動物科學學院， 新疆 阿拉爾 8433003)

牛乳頭瘤病是由牛乳頭瘤病毒(Bovine papillomavirus，BPV)引起的一種腫瘤性疾病[1]。臨床上主要表現(xiàn)為患病處有突出體表外的乳頭狀贅生瘤體，多以1歲左右牛感染發(fā)病且表現(xiàn)明顯。在牛乳頭瘤病毒基因型中，BPV-Ⅰ型和BPV-Ⅱ型可跨種間傳播，給動物健康造成影響[2,3]。

因乳頭瘤病毒基因型多達13種以上，而臨床診斷、病理學檢查只能作出初步判斷，且無法鑒定病毒基因類型。本研究在臨床診斷、組織病理學觀察基礎(chǔ)上，以乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白L1基因的通用引物MY11/MY09[4]對采集的疑似乳頭瘤病料樣本進行基因分型鑒定。

1 材料

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品的采集

本研究所采集病料來源于新疆南疆某養(yǎng)殖戶患病牛，經(jīng)臨床診斷初步確診后以手術(shù)方式收集體表贅生瘤樣品，一份保存于10%甲醛溶液中，另一份置于50%的甘油磷酸緩沖液并-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

D2000 Marker、2×Tap PCR Master Mix、T載體連接試劑盒、普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒、6×loading Buffer、溴化乙錠(EB)購自天根生化科技(北京)有限公司；組織DNA提取試劑盒E.Z.N.A.Tissue DNA Kit購自O(shè)mega公司；瓊脂糖(西班牙Biowest)、LB培養(yǎng)基(固、液)、氨芐青霉素購自寶信生物技術(shù)有限公司；其余耗材和試劑為國產(chǎn)或進口的分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 病理組織學觀察

取10%甲醛固定的體表贅生瘤，經(jīng)修塊處理后，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟、H.E.染色、脫水、透明、封片后在光學顯微鏡下觀察[5]。

1.2.2 引物設(shè)計

選取通用引物MY11/MY09作為BPV基因分型擴增引物，提交引物序列至生工生物工程(上海)股份有限公司并合成。引物序列參見表1。

表1 引物序列

1.2.3 病料處理

取-20 ℃保存的體表贅生瘤體樣品，經(jīng)研磨處理后以每管20～30 mg做為標準，于1.5 mL滅菌清潔的離心管中分裝，做好標記-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病料樣品DNA的提取

具體提取步驟參照Omega公司E.Z.N.A.Tissue DNA Kit試劑盒說明進行，核酸檢測儀內(nèi)檢測收集的DNA核酸濃度，封口，標記，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR檢測體系

采用50 μL PCR擴增反應體系：模板DNA 5. 0 μL，ddH2O 18. 0 μL，2×Tap Master Mix 25. 0 μL，引物Primer MY11 1. 0 μL，引物Primer MY09 1. 0 μL，混勻后瞬時離心。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；47. 5 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定擴增片段大小。

取部分PCR產(chǎn)物，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，拍照。將剩余PCR樣品全部點樣，切膠回收，回收步驟參照天根生物技術(shù)有限公司普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書進行。

1.2.6 T載體連接和產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞

取純化產(chǎn)物參照天根T載體連接試劑盒進行轉(zhuǎn)化連接，提取質(zhì)粒送至北京金锘銳杰基因科技有限公司測序。

1.2.7 序列分析

經(jīng)測序的陽性質(zhì)粒，以3次完全相同的結(jié)果為標準，作為測序結(jié)果，將測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫中進行在線Blastn比對，比對完成后在DNAStar軟件MegAlign中與GenBank中下載的BPV參考毒株進行Clustal W核苷酸同源性比對分析；比對后序列與參考序列的L1基因利用MEGA 6.0軟件采用鄰近法行系統(tǒng)發(fā)育分析，繪制遺傳進化樹。參考序列參見表2。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

患病牛右前肢關(guān)節(jié)處至蹄部可見明顯體表贅生瘤體，呈結(jié)節(jié)乳頭狀瘤，顏色灰褐色至深褐色，大小不等，于膝關(guān)節(jié)至蹄部連接成片，質(zhì)地堅硬，粗糙呈菜花狀(圖1)。

表2 GenBank中登錄的BPV參考株序列

圖1 牛乳頭狀瘤臨床癥狀觀察

2.2 病理組織學觀察

將采集患病牛的皮膚體表贅生瘤經(jīng)病理組織切片觀察后顯示，樣品病理切片表皮細胞各層增厚，表皮角質(zhì)化過度，顆粒細胞部分空泡化，并且存在嗜酸性包涵體(圖2)[5,6]。

注：A：箭頭所示為細胞空泡化；B：過度角質(zhì)化

2.3 PCR檢測結(jié)果

提取患病牛體表贅生瘤體樣品DNA，通用引物MY11/MY09進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測出與預期大小相符的約為460 bp的片段(圖3)。

注：M：DNA marker D2000；1：空白對照；2：PCR擴增片段圖3 PCR擴增結(jié)果

2.4 BPV L1基因核苷酸序列同源性分析

以通用引物MY11/MY09擴增得到的序列，經(jīng)測序后在NCBI中比對，結(jié)果表明，該測序序列與BPV-1型參考株的核苷酸同源性達到99%以上，命名為SY-12。與不同基因型的BPV參考株L1基因核苷酸序列同源性如下：與BPV-1型參考株(X02346和AB626705)的核苷酸同源性分別為99. 5%和99. 1%；與BPV-2型參考株(KC878306)和BPV-13型參考株(JQ798171)的核苷酸同源性均為83. 5%；而與BPV-3型參考株(AF486184)、BPV-4型參考株(X05817)、BPV-5型參考株(AF457465)、BPV-6型參考株(AJ620208)、BPV-7型參考株(NC-007612)、BPV-8型參考株(DQ098913)、BPV-10型參考株(AB331651)、BPV-11型參考株(AB543507)、BPV-12型參考株(JF834523)、BPV-9型參考株(AB331650)分別為60. 8%、56. 6%、62. 0%、59. 0%、59. 4%、62. 5%、57. 3%、57. 8%、62. 7%、59. 7%(圖4)。

圖4 多序列比對

2.5 遺傳進化樹分析

依據(jù)不同的BPV基因型L1基因參考序列，用MEGA6.0軟件，采用Neighbor-Joining Method對SY-12與不同基因型BPV參考株進行同源性比較，構(gòu)建遺傳進化樹如圖5。從圖中可以看出SY-12與參考株BPV-01型參考株X02346和BPV-1型參考株AB626705位于同一分支為BPV-1型牛乳頭瘤病毒，同時與BPV-02型參考株KC878306和BPV-13型參考株JQ798171位于同一分支上為Delta屬；證明SY-12株為BPV-1型乳頭瘤病毒；BPV-5型參考株(AF457465)和BPV-8型參考株(DQ098913)位于同一分支上為Epsilon屬；BPV-3型參考株(AF486184)、BPV-4型參考株(X05817)、BPV-11型參考株(AB543507)、BPV-10型參考株(AB331651)、BPV-9型參考株(AB331650)、BPV-6型參考株(AJ620208)、BPV-12型參考株(JF834523)位于同一分支上為Xi屬；BPV-7型參考株(NC-007612)為未被定義的PV屬[7]。

圖5 參照部分L1基因構(gòu)建遺傳進化樹

3 討論

新疆南疆某養(yǎng)殖戶疑似感染患病牛，經(jīng)PCR檢測、基因序列分析，確定該患牛感染BPV-1。

賀志昊在2014年對新疆北疆地區(qū)進行了BPV流行病學的調(diào)查，并得出主要流行株為BPV-2[8]；王青青2015年檢測出新疆南疆BPV-2型[5]；史巧蕓2015年在海南完成了對BPV-13的研究工作[9]；彭昊2016年在廣西檢測出BPV-1[10]；張海2017年在貴州檢測出BPV-2型[11]；證實在國內(nèi)，新疆地區(qū)存在BPV不同基因型感染。

常規(guī)的臨床檢查并不能完全確定該病的發(fā)生，易造成漏診、誤診情況的發(fā)生。L1基因是病毒基因組中保守的基因片段，被廣泛用于基因分型。依據(jù)L1基因設(shè)計簡并引物和通用引物常用于檢測乳頭狀瘤病毒感染和基因型鑒定[12]。

參照核苷酸同源性比對分析和系統(tǒng)進化樹分析，新疆南疆牛乳頭瘤病毒序列SY-12株與BPV-01型參考株(X02346和AB626705)的核苷酸同源性分別為99. 5%和99. 1%，均為BPV-1型，并且與BPV-02型參考株KC878306和BPV-13型參考株JQ798171位于同一分支上為Delta屬。通過核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，本實驗發(fā)現(xiàn)SY-12株病毒基因型與BPV-01型參考株X02346的核苷酸同源性達到99. 5%，均為Delta屬。

通過對新疆南疆BPV-1型SY-12株的基因分型鑒定，為下一步研究BPV-1型全長基因序列奠定基礎(chǔ)，為后續(xù)新疆南疆地區(qū)動物感染乳頭瘤病毒流行病學研究及病毒基因數(shù)據(jù)庫的建立具有重要意義。