鮑慧瑋，徐 陽(yáng)，劉芳馨

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林長(zhǎng)春 130000)

鹽酸麻黃堿[(1R，2S)-(-)-ephedrine hydrochloride](圖1)為麻黃科植物草麻黃(EphedrasinicaStapf)、中麻黃(EphedraintermediaSchrenk et C. A. Mey.)或木賊麻黃(EphedraequisetinaBge.)的活性物質(zhì)，也是《中國(guó)藥典》(2015年版)中麻黃的質(zhì)控指標(biāo)之一[1]。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)與腎上腺素相似，麻黃堿具有擬腎上腺素樣作用，可用于支氣管哮喘、百日咳、枯草熱及其他過(guò)敏性疾病，能對(duì)抗脊椎麻醉引起的血壓降低、擴(kuò)大瞳孔，也用于重癥肌無(wú)力、痛經(jīng)等疾患，還可作中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑[2-4]。

藥物的血漿蛋白結(jié)合率是影響藥物發(fā)揮藥效的重要因素，是研究藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物作用機(jī)制等方面的參數(shù)依據(jù)[5-6]。鹽酸麻黃堿的藥理作用廣泛，而文獻(xiàn)中未曾報(bào)導(dǎo)過(guò)對(duì)鹽酸麻黃堿血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定的研究，故本實(shí)驗(yàn)采用超濾法結(jié)合HPLC法[7-8]對(duì)鹽酸麻黃堿與小鼠、大鼠、家兔血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定進(jìn)行研究，以期為其更準(zhǔn)確的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

圖1 鹽酸麻黃堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-2030型高效液相色譜儀(日本島津公司)；TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司)；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；SK-1快速混勻器(江蘇金壇市江南儀器制造廠)；DT5001型電子稱(常熟市意歐儀器儀表有限公司)；AB135-S型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；Millipore 10K型超濾管(美國(guó)Millipore公司)。

鹽酸麻黃堿(批號(hào)：171237-200807，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀(分析純，北京化工廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，體重200±20 g；昆明種小鼠，體重20±2 g；家兔，體重2.0±0.5 kg(合格證號(hào)：SCXK(吉)-2016-0003、SCXK(吉)-2016-0004，長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

小鼠、大鼠、家兔分別采用摘眼球、眼眶、耳緣靜脈方式取血，置肝素潤(rùn)洗的離心管中，4000 r·min-1離心10 min，分離血漿，置4℃冰箱中備用。

1.3 溶液的配制

1.3.1 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的配制

取磷酸二氫鉀1.36 g，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液79 mL，用水稀釋至200 mL，即得pH為7.4的PBS溶液。

1.3.2 對(duì)照品溶液的配制

稱取鹽酸麻黃堿約25 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇超聲溶解，并定容至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為5.036 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿對(duì)照品儲(chǔ)備液；再精密吸取1 mL，置10 mL量瓶中，PBS溶液稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得質(zhì)量濃度為0.5036 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液。

1.3.3 血漿樣品溶液的處理

取已配制好的對(duì)照品溶液，分別精密移取10 μL、40 μL、100 μL于EP管中，再取新鮮血漿900 μL加入上述溶液中(PBS溶液補(bǔ)足體積至1000 μL)，渦旋震蕩，制得低、中、高3種濃度的鹽酸麻黃堿血漿樣品溶液，置37℃水浴2 h。分別吸取鹽酸麻黃堿血漿樣品溶液500 μL至超濾管中，6000 r·min-1離心20 min，即得不同濃度的血漿樣品超濾液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件與專屬性考察

Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇∶0.1%磷酸溶液(15∶85，v/v)，體積流量為1.0 mL·min-1，柱溫為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

吸取PBS溶液100 μL置EP管中，再加入新鮮血漿900 μL置37℃水浴2 h，按照1.3.3制得空白血漿超濾液。在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，待測(cè)色譜峰峰形良好，與其它色譜峰分離度大于5.0，且無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。結(jié)果見(jiàn)圖2(以大鼠血漿為例)。

A.鹽酸麻黃堿對(duì)照品；B.大鼠血漿樣品超濾液；C.空白血漿超濾液圖2 鹽酸麻黃堿HPLC色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

精密吸取1.3.2對(duì)照品儲(chǔ)備溶液20 μL，至2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得濃度為50.36 μg·mL-1的對(duì)照品母液。分別移取對(duì)照品母液0.15、0.2、0.5、1、2、5 mL至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得一系列不同濃度的鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液。按照上述色譜條件進(jìn)入檢測(cè)，記錄峰面積。以鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度(c，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得鹽酸麻黃堿的線性回歸方程為y=47920x-21732(r=0.9997)。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度在1.511～50.36 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度考察

取1.3.3中濃度大鼠血漿樣品超濾液，分別在不同日期、不同人員、不同儀器下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度。結(jié)果，大鼠血漿樣品超濾液中鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度的RSD值為1.77%，表明該方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

取1.3.3中濃度大鼠血漿樣品超濾液，分別在0、2、4、6、8、12 h時(shí)于上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積。結(jié)果，大鼠血漿樣品超濾液中鹽酸麻黃堿峰面積的RSD值為1.84%，表明該方法在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性考察

分別取新鮮血漿6份，按照1.3.3制備中濃度大鼠血漿樣品超濾液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度。結(jié)果，大鼠血漿樣品超濾液中鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度的RSD值為1.13%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 超濾膜回收率試驗(yàn)

取1.3.2中對(duì)照品溶液，分別精密移取10 μL、40 μL、100 μL于EP管中，加入PBS溶液至體積1000 μL，渦旋震蕩，可得濃度約為5 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1的鹽酸麻黃堿-PBS溶液，置于37℃水浴溫育2 h。分別精密移取500 μL至超濾管中，6000 r·min-1離心20 min，即得不同濃度的超濾液。對(duì)不同濃度的鹽酸麻黃堿-PBS溶液和超濾液分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算超濾膜回收率。結(jié)果，低、中、高濃度的膜回收率分別為(99.47±1.22)%、(96.44±0.83)%、(95.11±0.79)%，RSD值分別為1.23%、0.86%、0.83%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.7 血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定

取1.3.3中不同濃度的血漿樣品超濾液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，并計(jì)算其血漿蛋白結(jié)合率。結(jié)果見(jiàn)表1。

其中，C超濾前為超濾前含藥物的PBS溶液的濃度；C超濾后為相應(yīng)血漿樣品超濾液的濃度。

由表1結(jié)果可知，鹽酸麻黃堿與不同屬血漿的蛋白均屬于較弱結(jié)合。通過(guò)SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，鹽酸麻黃堿與不同屬血漿的蛋白結(jié)合率均無(wú)濃度依賴性，但不同屬血漿與鹽酸麻黃堿的蛋白結(jié)合率有顯著性差異(p<0.05)。

表1 不同屬血漿的蛋白結(jié)合率

3 討論

藥物經(jīng)吸收進(jìn)入血液后，一部分與血漿蛋白結(jié)合為結(jié)合型藥物，只有另一部分游離型的藥物才能發(fā)揮藥效。本文通過(guò)測(cè)定血漿中游離鹽酸麻黃堿的含量，來(lái)計(jì)算藥物與血漿的蛋白結(jié)合率。經(jīng)分析，鹽酸麻黃堿與小鼠、大鼠、家兔血漿蛋白均具有較弱的結(jié)合，且與濃度不成比，在臨床應(yīng)用中，需避免因競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合而引起的游離鹽酸麻黃堿濃度升高，為更合理用藥提供依據(jù)。

根據(jù)查閱的文獻(xiàn)，血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定方法有平衡透析法、微透析法、超濾法、超速離心法、以光譜學(xué)為基礎(chǔ)的方法、高效親和色譜法、微量熱法等[9-11]。本文采用超濾法與HPLC法結(jié)合的方法，利用半透膜原理，設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、不受體積遷移和稀釋效應(yīng)的影響，建立一種準(zhǔn)確、速率高、成本低的方法實(shí)現(xiàn)血漿中游離藥物的快速分離。

超濾膜的吸附作用會(huì)影響血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定結(jié)果[12]。根據(jù)超濾膜吸附率的測(cè)定結(jié)果分析，濃度越高，吸附率也越大。為了排除吸附率的干擾，計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率時(shí)，應(yīng)用采用超濾膜吸附之后的實(shí)際濃度進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果更加準(zhǔn)確。