蔡晶晶，王雅潔，王 薔，宋小平

(安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽合肥 230601)

亮菌因菌絲體能在暗處發(fā)出淺藍(lán)色的熒光而得名，屬于擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，假蜜環(huán)菌屬，為一種藥食兼用的名貴食用菌[1]。亮菌營(yíng)養(yǎng)豐富，具有良好的藥用價(jià)值，具有提高免疫力、抗腫瘤、消炎、抗菌、防輻射等作用。中醫(yī)認(rèn)為亮菌味甘性寒，具有強(qiáng)筋壯骨、疏風(fēng)活絡(luò)、名目利肺、益腸胃等保健功能[2-3]。臨床上常用的亮菌口服液是以亮菌為原材料開發(fā)的。亮菌口服液主要成分之一即為亮菌多糖，具有提高免疫功能，抗氧化、抗衰老，預(yù)防心腦血管疾病，逆轉(zhuǎn)酒精導(dǎo)致的肝損傷，促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)的生物合成和組織損傷修復(fù)等功效[4]。

亮菌多糖含量測(cè)定既為亮菌口服液、亮菌糖漿制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)之一，也是亮菌多糖活性研究中的基本內(nèi)容。亮菌多糖成分復(fù)雜，由多種單糖組成，由于不同單糖與化學(xué)試劑的顯色深度不同，采用不同單糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率也不同[5]。如葡萄糖、阿拉伯糖顯色最深，甘露糖、木糖較淺，半乳糖、巖藻糖顯色更淺。在測(cè)定多糖混合物時(shí)，因單糖組成不同造成誤差，導(dǎo)致樣本測(cè)定結(jié)果因標(biāo)準(zhǔn)品而異，可信度低。本文擬分析亮菌多糖的單糖組成，評(píng)估適當(dāng)?shù)膯翁菢?biāo)準(zhǔn)品以替代目前國(guó)標(biāo)中的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量，以期得到更為科學(xué)的亮菌多糖測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)、美譜達(dá)UV-1100紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)。

亮菌固體發(fā)酵菌由合肥誠(chéng)志生物制藥有限公司提供。單糖標(biāo)準(zhǔn)品鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、核糖(Rib)、巖藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)，半乳糖醛酸(GalUA)標(biāo)準(zhǔn)品均為sigma公司產(chǎn)品；乙腈為色譜純；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、三氟乙酸、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、磷酸氫二鉀、苯酚等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 亮菌多糖的制備

取亮菌固體發(fā)酵菌，加水80℃提取2 h，過濾取上清液，減壓濃縮至1/3體積后，加三倍體積95%乙醇，4℃靜置12 h后，3000 rpm離心10 min，棄去上清液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌三次，3000 rpm離心10 min，取沉淀。沉淀用水溶解后，真空冷凍干燥。取適量亮菌多糖凍干粉用水溶解制成濃度為2%的溶液，用Sevag法去除亮菌粗多糖中的蛋白質(zhì)，共去除5次，再經(jīng)活性炭脫色，得亮菌多糖溶液，經(jīng)真空冷凍干燥，凍干粉保存。

1.3 亮菌多糖的組成分析

采取1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定亮菌多糖組成[6-7]。以鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸十種單糖的混合對(duì)照品溶液同法處理做對(duì)照。精密稱定適量亮菌多糖凍干粉于100 mL錐形瓶中，加入4 mol·L-1的三氟乙酸溶液1.0 mL，置120℃條件下水解120 min。70℃水浴，氮吹儀吹干。向水解干燥后得到的樣品及上述混合對(duì)照品溶液中分別加入0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液和0.3 mol·L-1的NaOH溶液各0.5 mL，充分混勻后，水浴70℃，反應(yīng)30 min。冷卻至室溫后加入0.3 mol·L-1HCl 0.5 mL中和，充分混勻。再加入1 mL氯仿，充分振蕩萃取，去除氯仿層，共萃取三次。水層用0.22 μm的濾膜濾過后，待上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件及結(jié)果

色譜條件如下：色譜柱：Thermo C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液∶乙腈=82∶18(v/v)；流速為1.0 mL/min；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm。

1.Man 2.Rib 3.Rha 4.GlcUA 5.GalUA 6.Glc 7.Gal 8.Xyl 9.Ara 10.FucA.混合標(biāo)準(zhǔn)品的PMP衍生產(chǎn)物HPLC圖；B.亮菌多糖的PMP衍生產(chǎn)物HPLC圖圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品和亮菌多糖的PMP衍生產(chǎn)物HPLC色譜圖

通過與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較發(fā)現(xiàn)，亮菌多糖主要由六種單糖組成，結(jié)合各標(biāo)準(zhǔn)糖的峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算出亮菌多糖中組成糖的含量分別為：甘露糖9.65%、葡萄糖42.72%、半乳糖25.60%、木糖9.81%、阿拉伯糖6.64%、巖藻糖3.94%。另兩種單糖含量非常低，分別為核糖與葡萄糖醛酸，兩者共占1.64%。

2.2 硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量

2.2.1 硫酸-苯酚法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取無水萄葡糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)各10 mg，加水溶解定容至100 mL，搖勻，即得到0.1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)單糖溶液則按照1.3中檢測(cè)的各種亮菌單糖的質(zhì)量組成比例配制成濃度為0.1 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液。采用硫酸-苯酚法測(cè)定[5]，分別精密量取0.1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)糖溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL置具塞試管中，依次添加水至2.0 mL，以2.0 mL水為空白對(duì)照。各管加入5%苯酚1 mL，搖勻后，迅速加入濃硫酸5.0 mL，立即搖勻，置40℃水浴中保溫30 min，取出于冰浴中放置5 min，測(cè)定490 nm處的吸光值。

主要幾種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 各種單糖及混合糖的硫酸-苯酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)混合糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=13.134x-0.0332(0.02～0.07 mg·mL-1),相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，方程擬合度良好。從標(biāo)準(zhǔn)曲線及依據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定值可以得出，以甘露糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線所計(jì)算的結(jié)果與混合標(biāo)準(zhǔn)單糖最為接近。

2.2.2 不同標(biāo)準(zhǔn)曲線下的亮菌多糖含量

精密稱定1.2中制備的亮菌多糖凍干粉10 mg，蒸餾水溶解定容至100 mL，取出25 mL，再定容至50 mL后做亮菌多糖供試液，該亮菌多糖供試液理論濃度為0.05 mg·mL-1。

取亮菌多糖供試液2 mL，參照2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線中檢測(cè)方法，采用不同標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算得到的多糖濃度與供試液理論濃度0.05 mg·mL-1的比值如表1所示。

表1 不同標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得亮菌多糖含量結(jié)果

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取0.1 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液稀釋兩倍后，取出2 mL，參照2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線中檢測(cè)方法，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果RSD為0.22%。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取2.2.2中亮菌多糖供試液6份，每份2 mL，參照2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線中檢測(cè)方法，考查方法的重復(fù)性。結(jié)果RSD為1.72%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性考查

取2.2.2中亮菌多糖供試液3份，每份2 mL，參照2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線中檢測(cè)方法，分別在反應(yīng)結(jié)束后的10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min、120 min、150 min進(jìn)行490 nm處吸光度的測(cè)定，RSD值分別為0.97%、1.12%、1.54%，表明數(shù)值在150 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

以混合標(biāo)準(zhǔn)單糖為對(duì)照，硫酸-苯酚法測(cè)定亮菌多糖的含量。取亮菌多糖溶液樣本適量與混合標(biāo)準(zhǔn)單糖按表2所示的量混合，不足部分用水補(bǔ)充體積至2 mL，參照2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線中檢測(cè)方法，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為102.38%，RSD為2.73%。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

多糖常用的測(cè)定方法有硫酸-苯酚法與硫酸-蒽酮法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩種方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性均較好，但相較于硫酸-苯酚法，在應(yīng)用過程中硫酸-蒽酮法有以下不足：一是反應(yīng)條件需要煮沸，且所用的硫酸是強(qiáng)腐蝕性試劑，煮沸環(huán)節(jié)增加了實(shí)驗(yàn)的安全風(fēng)險(xiǎn)和管理風(fēng)險(xiǎn)；二是測(cè)定吸光值時(shí)，硫酸-蒽酮與糖反應(yīng)產(chǎn)物附著在玻璃比色皿壁，清洗時(shí)需用乙醇浸泡才能去除反應(yīng)殘留物，這增加了洗滌難度和成本。同時(shí)，硫酸-蒽酮法測(cè)定的是樣本中所有的碳水化合物，易受樣本中蛋白質(zhì)等非多糖化合物的干擾，而硫酸-苯酚法用于多種糖類的顯色反應(yīng)，且基本不受蛋白質(zhì)雜質(zhì)的影響，因此用于多糖測(cè)定具有更高的專屬性[8-9]。

硫酸-苯酚法來測(cè)定亮菌多糖含量原理為多糖會(huì)在濃硫酸的作用下水解成單糖，再脫水形成呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的糠醛衍生物，糠醛衍生物可與苯酚等物質(zhì)反應(yīng)生成有色化合物，因此選擇與樣品的單糖組成相近的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)含量測(cè)定結(jié)果至關(guān)重要。而亮菌糖漿制劑大多為亮菌固體發(fā)酵多糖制劑，單糖成分復(fù)雜，含量尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步研究多糖含量測(cè)定方法。

本文采用PMP-HPLC方法測(cè)定了亮菌糖漿中的單糖組成，得出其單糖組成主要由葡萄糖(42.72%)、半乳糖(25.60%)、木糖(9.81%)、甘露糖(9.65%)、阿拉伯糖(6.64%)、巖藻糖(3.94%)構(gòu)成。用HPLC法也可以建立各種單糖的含量測(cè)定線性方程，分別測(cè)定各個(gè)單糖含量，方法可靠但過程繁瑣。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選擇硫酸-苯酚法進(jìn)行亮菌多糖含量測(cè)定，以方便在實(shí)驗(yàn)室批量檢測(cè)或工業(yè)應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明硫酸-苯酚法測(cè)多糖含量時(shí)在0.02～0.07 mg·mL-1范圍線性關(guān)系良好，加標(biāo)準(zhǔn)品的回收率高。

同種亮菌粗多糖樣品，分別采用上述6種含量較高的單糖及按單糖比例組成的混合物為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)結(jié)果表明，以巖藻糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得樣本中多糖含量值大于200%，以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品則大于100%，以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得值為75.41%，按照單糖組成比例的混合標(biāo)準(zhǔn)品做曲線測(cè)得值為74.95%，與以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果基本一致。而以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的多糖值最低，為56.24%。因此，采用傳統(tǒng)方法中的葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)低估樣本中的多糖含量。依據(jù)亮菌多糖的單糖組成比例制備混合標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定總糖含量更為準(zhǔn)確，但是混合標(biāo)準(zhǔn)品配制繁瑣，也可用甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)品。用甘露糖或者混合單糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合硫酸-苯酚法可以較為準(zhǔn)確地檢測(cè)亮菌多糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該法的重復(fù)性好、精密度高、顏色穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)，測(cè)定亮菌多糖含量準(zhǔn)確、可靠。