佟桂芝 海龍 李信濤 董正德 王偉霞 宋斌 李玉龍 郭立宏 王嘉厚

摘要：羔羊卵母細(xì)胞作為體外胚胎生產(chǎn)的試驗(yàn)材料，越來(lái)越多地得到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。為了利用羔羊超數(shù)排卵的卵子擴(kuò)展體外受精所需卵子的來(lái)源、縮短世代間隔、產(chǎn)生大量?jī)?yōu)秀后代、加速育種進(jìn)程，國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛進(jìn)行了羔羊超排后進(jìn)行活體采卵及體外受精、胚胎移植實(shí)驗(yàn)，目前已經(jīng)取得了一定的成果。但總體效率還不是很高，利用羔羊作為供體來(lái)生產(chǎn)胚胎時(shí)，常出現(xiàn)個(gè)體對(duì)激素誘導(dǎo)無(wú)任何反應(yīng)現(xiàn)象。本文對(duì)生殖激素的使用、羔羊超排反應(yīng)、卵母細(xì)胞發(fā)育效率、卵母細(xì)胞的基因表達(dá)、卵母細(xì)胞及受精卵培養(yǎng)體系的優(yōu)化等影響因素進(jìn)行總結(jié)與分析，提出羔羊超排存在的問(wèn)題并展望其發(fā)展前景，為這一技術(shù)能在更多家畜繁殖領(lǐng)域的商業(yè)化生產(chǎn)提供參考資料。

關(guān)鍵詞：羔羊;超數(shù)排卵;腹腔鏡采卵

中圖分類(lèi)號(hào)：S826.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2095-9737（2018）10-0047-02

我國(guó)開(kāi)展羔羊超排研究是從2005年著手開(kāi)展引進(jìn)，首先應(yīng)用于肉羊繁殖育種上，2006年該技術(shù)應(yīng)用于奶牛優(yōu)良品種繁育上。該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用加快了良種的快速繁育，對(duì)推動(dòng)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展具有重要意義。目前應(yīng)用羔羊卵母細(xì)胞進(jìn)行胚胎生產(chǎn)的效率低下，仍然需要進(jìn)一步研究。同時(shí)，羔羊卵泡發(fā)育效果受許多因素的影響，如羔羊品種、激素處理方法、采卵方法等。為提高羔羊體外胚胎生產(chǎn)效率，加大良種羊的擴(kuò)繁速度和縮短育種世代間隔，現(xiàn)從羔羊超排方法、卵子不同采集方法、超排月齡、品種等因素對(duì)超排后卵母細(xì)胞數(shù)量的影響進(jìn)行分析，為提高綿羊體外胚胎生產(chǎn)效率提供一定的理論依據(jù)。

1 羔羊月齡對(duì)超排羔羊卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞采集情況的影響

羔羊超排時(shí)月齡是影響超排效果的關(guān)鍵因素之一，超數(shù)排卵的目的是能實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞的最大獲取量。Earl.CR等報(bào)道[1]，母羊在妊娠期的135天開(kāi)始，胎兒卵巢上才開(kāi)始出現(xiàn)有腔卵泡，出生時(shí)數(shù)量明顯增加。卵泡發(fā)育在羔羊出生后4～8周齡時(shí)達(dá)到高峰，但隨著青春期的到來(lái)開(kāi)始減少。羔羊在1月齡時(shí)進(jìn)行外源激素誘導(dǎo)后，卵巢上具有繁育過(guò)程中最多數(shù)目的卵泡發(fā)育。而后隨著年齡的增長(zhǎng)，卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)有所下降，到初情期后保持相對(duì)穩(wěn)定。于勇等[2]對(duì)1、3月齡羔羊進(jìn)行外源激素FSH+PMSG處理，發(fā)現(xiàn)兩者卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)存在顯著差異，3月齡羔羊卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)僅為其1/4左右，顯著低于1月齡羔羊的卵泡數(shù)。不同月齡羔羊在相同激素處理下卵巢及子宮的發(fā)育情況FSH+PMSG處理后卵巢、子宮1月齡羔羊較3月齡羔羊變化明顯的結(jié)果相似。幼齡動(dòng)物進(jìn)行激素處理時(shí)，年齡是個(gè)重要的影響因素。

趙金紅（2015研究發(fā)現(xiàn)，4～8周齡羔羊組卵巢超排反應(yīng)、回收卵母細(xì)胞數(shù)、可用卵母細(xì)胞數(shù)與8～12周齡、12～16周齡組差異顯著（P<0.05）。4～8周齡酉州烏羊幼羔在激素處理后卵巢長(zhǎng)度和寬度明顯高于1216周齡組。Morton等[4]研究結(jié)果表明，羔羊出生后早期，繁殖器官生長(zhǎng)明顯，4、8周齡時(shí)卵巢重量比出生時(shí)分別增加6.8倍和10.8倍，8～12周齡時(shí)卵巢增重開(kāi)始下降，直至33周齡時(shí)保持恒定。Ptak等[5]研究表明，1月齡羔羊超排效果最好，3月齡最差。

2 羔羊出生重及超排時(shí)體重

影響超排效果的動(dòng)物因素主要包括個(gè)體和遺傳的差異等。代相鵬等[6]的研究結(jié)果表明，體重和超排季節(jié)對(duì)供體超排效果沒(méi)有顯著影響。劉太宇等[7]的研究結(jié)果表明，授精方式等因素對(duì)超排效果沒(méi)有顯著影響。秦雪等[8]對(duì)6～8周齡的健康杜晉綿羊進(jìn)行超數(shù)排卵，結(jié)果表明：初生重與卵母細(xì)胞數(shù)量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），超排時(shí)體重與卵母細(xì)胞數(shù)量相關(guān)不顯著（P>0.05）。超排時(shí)體重不是影響羔羊超排效果的主要因素。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)選擇初生重大及超排時(shí)體重良好的羔羊進(jìn)行超數(shù)排卵，這些羊的體況及營(yíng)養(yǎng)狀況都能夠達(dá)到更好的水平，有助于提高羊群的質(zhì)量。

3 超排激素及超排方案對(duì)羔羊超排效果的影響

常規(guī)幼畜的超排方法主要是利用促性腺激素FSH（PMSG）和LH誘導(dǎo)其卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育。目前羔羊超排方法一種是孕酮+促性腺激素法，另一種是促性腺激素法;主要有GnRH、FSH+LH法，獲得的卵母細(xì)胞數(shù)存在差別。Morton K M等[4]對(duì)30～40日齡的羔羊進(jìn)行激素超排，每只羔羊平均得到86.2±7.9枚卵母細(xì)胞。Ptakt[5]等給1月齡的羔羊放置孕酮栓8天，第8天撤栓，第5～7天每天注射FSH2次，獲得平均每只羔羊29枚卵母細(xì)胞。胡鵬飛[9]對(duì)2月齡的雜種羊利用促性腺激素超排后平均獲得15.。枚卵母細(xì)胞。魯彥（2011）[10]采用兩種超排方案對(duì)新疆細(xì)毛羊羔羊進(jìn)行超排：結(jié)果加拿大激素和寧波激素超排效果兩者采用等量法超排的卵母細(xì)胞數(shù)差異不顯著;加拿大激素減量法超排效果較差，寧波FSH超排卵數(shù)從20～230枚。Gou等數(shù)82枚。谷振慧[12]采用加拿大激素超排處理102只4～8周齡的羔羊，平均獲卵數(shù)79枚。秦雪（2014）[8]用FSH+PMSG方案獲得發(fā)育卵泡數(shù)顯著高于FSH+LH方案。FSH在體內(nèi)的半衰期短，需要多次注射;PMSG單獨(dú)使用會(huì)導(dǎo)致未排卵的卵泡數(shù)量增加。陳童等[13]對(duì)4～9周齡的超細(xì)型澳洲美利奴。間隔12h連續(xù)進(jìn)行6次FSH肌肉注射，F(xiàn)SH總劑量為120mg。其中一組在第5次注射FSH的同時(shí)，肌肉注射 PMSG 400萬(wàn)IU，另外一組不注射PMSG。試驗(yàn)在超排效果上不斷優(yōu)化，使用國(guó)產(chǎn)激素達(dá)到了比較穩(wěn)定而且較好的效果;卵母細(xì)胞回收率也在熟練中不斷提高?？朔萍s羔羊超排產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的主要障礙。不斷完善幼畜超排方法、程序，以提高體外胚胎生產(chǎn)效率及探索適宜的超排方法來(lái)穩(wěn)定超排效果。幼畜卵泡庫(kù)對(duì)于育種和科研等方面的意義和潛力絕對(duì)是不容忽視的。

4 采卵方法

手術(shù)采卵法：剖腹手術(shù)將卵巢和子宮引出體外，隨后抽吸卵泡液。與內(nèi)窺鏡法相比，本法對(duì)羔羊的損傷較大，術(shù)后易發(fā)生黏連，但可以直觀的觀測(cè)卵泡的發(fā)育，卵回收率高。將供體羔羊保定好，肌注0.1mL左右靜松靈進(jìn)行麻醉，縱向切一個(gè)3cm切口，從切口將卵巢拉出，用10mL注射器（提前吸有2mL抽卵液）抽吸卵巢上2～8mm卵泡液，抽卵結(jié)束時(shí)，將抽卵液轉(zhuǎn)移入50mL離心管，37℃水浴鍋中沉淀10～20min，在實(shí)體顯微鏡下選擇形態(tài)正常的卵子。采卵完畢，再往腹腔中倒人200mL預(yù)先溫35℃的生理鹽水。給羔羊注射0.1mL左右蘇醒靈。

腹腔鏡采卵法：借助腹腔鏡觀察卵巢狀態(tài)，然后利用操作桿和采卵針的配合將卵泡中的卵母細(xì)胞采集出來(lái)，具有手術(shù)切口小、對(duì)羔羊應(yīng)激小、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。但內(nèi)窺鏡等設(shè)備價(jià)格昂貴。該法對(duì)羔羊傷害較小，羔羊可以重復(fù)超排，對(duì)成年后的生育能力并不受影響。

摘出卵巢取卵法：將羔羊卵巢摘取后帶回實(shí)驗(yàn)室，用抽吸或切割的方法獲得卵母細(xì)胞。這種方法卵母細(xì)胞效率較高，減少了活體采卵時(shí)凝血的發(fā)生，但摘取卵巢后影響了母羊的使用價(jià)值。

供體羔羊每次超排處理所獲卵母細(xì)胞數(shù)量會(huì)隨重復(fù)超排次數(shù)的增加而逐漸減少，間隔3周重復(fù)超排，幼羔的獲卵數(shù)較初次超排降低。Morton K M等[4]認(rèn)為卵巢對(duì)激素的反應(yīng)性降低是導(dǎo)致重復(fù)超排所獲卵母細(xì)胞數(shù)量下降的主要原因。

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