文|鄭美麗（北京市畜牧總站）

豬GPS2基因的克隆及表達分析

文|鄭美麗（北京市畜牧總站）

G蛋白途徑抑制因子2（G-protein pathway suppressor,GPS2）是近年來新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，是一種多功能蛋白質(zhì)，參與了多個細胞的進程，能夠抑制酵母中由于G-蛋白信號通路持續(xù)激活引起的死亡。目前，GPS2基因的研究領域主要分布在人、小鼠等。在人的領域，有最新研究表明GPS2基因調(diào)控細胞核中的基因表達。這項研究發(fā)現(xiàn)GPS2在細胞膜水平上負調(diào)控腫瘤壞死因子-α激活(TNF-α)的信號級聯(lián)反應中起著至關重要的作用。他們發(fā)現(xiàn)增加GPS2的水平會損害細胞對TNF-α的反應，降低炎癥反應。鑒于此信息，研究人員分析假如脂肪組織中有更多GPS2的話，是否有助于降低肥胖患者胰島素抵抗的發(fā)展。結果發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中的胰島素信號被大大改善。然而在核中過表達的GPS2對肝功能也有負面影響。另外其研究表明GPS2在減輕炎癥反應中起著重要的調(diào)節(jié)功能。這些研究結果揭示了一個針對2型糖尿病和代謝綜合征等疾病治療的潛在的新方向。本實驗則是基于實驗室前期全基因組關聯(lián)分析（GWAS）工作，篩選出GPS2基因，針對目前GPS2基因的研究成果，考慮到該基因可能與豬的脂肪沉積有所關聯(lián)，因而進行初步的基因克隆和序列分析，并研究其在長白豬種的不同組織表達情況差異，從而確定該基因是否對豬的脂肪沉積有確定的規(guī)律性影響，為后期的深入工作做探索。

GPS2；基因克??；序列分析；熒光定量PCR

一、材料與方法

1.實驗材料。所選品種為長白豬，樣品為中國農(nóng)業(yè)大學動物遺傳資源實驗室群體樣品中隨機抽取。選取樣品為脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺、腎、腦。

2.實驗方法。

（1）RNA的提取和cDNA的合成。利用動物組織總RNA提取試劑盒，分別對長白豬的脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺、腎、腦的樣品進行了mRNA的提取，通過NANODROP2000濃度測定儀測定RNA溶液濃度，并檢測其提取質(zhì)量。利用瓊脂糖凝膠電泳的方法進一步檢測所提取的mRNA溶液的質(zhì)量。利用提取的mRNA，進行cDNA的合成，試劑盒為第一鏈合成試劑盒（去基因組）。

（2）CDS區(qū)的克隆測序及結構分析。通過PCR克隆測序技術，得到GPS2基因的CDS區(qū)，引物序列為：F: TAAGCTAGCGGAGAAAGCGACGAGAAGAC；R: CGAATTCCTGGGAGCGAGGTTGATAGAC；退火溫度為58℃。對擴增的產(chǎn)物進行回收，連接轉化后，提取質(zhì)粒，送到測序公司進行測序，從而得到GPS2基因的CDS區(qū)序列。然后利用ProtParam（http://web.expasy.org/ protparam/）、Jpred（http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/index.html）、Robetta（http://robetta.bakerlab. org/）等軟件及平臺，對其進行初步的結構分析。

（3）GPS2基因的表達分析。根據(jù)GPS2基因的CDS區(qū)序列，設計引物，進行熒光定量PCR實驗，引物序列為F：TCAGAGCACCTTCGGCATTT；R: AGCCAGTTTGTTGGTTAGCG；退火溫度為60℃，退火時間為10秒，測定GPS2基因在長白豬不同組織的表達情況并分析。

二、實驗結果

1.GPS2基因的CDS區(qū)序列。本實驗通過對GPS2基因進行PCR擴增，所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一明亮條帶（圖1）。將產(chǎn)物回收純化并連接轉化后，測序并將所得到的無載體序列與NCBI上序列比對分析，獲得了豬GPS2基因的CDS區(qū)準確序列（圖2）。

◎圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

◎圖2 GPS2基因的CDS區(qū)序列測定結果

2.GPS2基因的一級結構分析。ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）軟件能檢索蛋白質(zhì)序列理化參數(shù)，包括分子質(zhì)量、理化等電點、氨基酸組成、原子組成、半衰期等，GPS2基因的CDS區(qū)所對應氨基酸序列見圖3。通過軟件分析其一級結構。

3.GPS2基因的二級結構分析。蛋白質(zhì)的二級結構是指氨基酸殘基形成的α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲及模體等組件。二級結構是通過骨架上的羰基和酰胺基團之間形成的氫鍵維持的。各種蛋白質(zhì)依其一級結構特點在其多肽鏈的不同區(qū)段可形成不同的二級結構。Jpred（http://www. compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/index. html），由Barton Group創(chuàng)建于1998年，應用Jnet神經(jīng)網(wǎng)絡算法，平均準確率達到81%。通過登陸此二級結構預測服務器，分析得到GPS2基因蛋白質(zhì)的二級結構預測結果，預測該蛋白在21～26、31～77、83～125、128、169～171、236～240、272～276區(qū)域可能為α螺旋結構；在129～131、146～151、163～164區(qū)域可能為β折疊結構（圖4）。

4.GPS2基因的三級結構分析。在一些較小的蛋白質(zhì)分子中一般只具有單結構域，這時，其三級結構就是它的結構域。在較大的蛋白質(zhì)分子中，則由兩個或者多個相對獨立的結構與組合并折疊成在空間上可明顯區(qū)分的三維結構。Robetta（http:// robetta.bakerlab.org/）是由華盛頓大學baker實驗室開放和維護的網(wǎng)絡計算平臺，用于非商業(yè)性的ab initio 和比較建模，提供自動化的蛋白質(zhì)結構預測結果。通過該平臺得到蛋白質(zhì)三級結構預測結構（圖5）。

5.GPS2基因在長白豬不同組織的表達分析。利用實時熒光定量PCR對心、肝、脾、肺、腎、肌肉、腹脂、腦各組織的GPS2基因表達水平進行檢測，以目的基因和內(nèi)標基因的比值作為目的基因的表達量，得到表達結果（圖6），發(fā)現(xiàn)在長白豬不同組織中，GPS2基因在腹脂中表達量顯著高于其他組織。

◎圖3 GPS2基因的CDS區(qū)所對應的氨基酸序列

◎圖4 JalView二級結構圖形結果

◎圖5 蛋白質(zhì)三級結構預測結果

◎圖6 GPS2基因在各組織中的表達檢測

三、討論

本實驗共分為三個部分：GPS2基因的克隆、序列分析及不同組織的表達分析。其中，通過克隆GPS2基因，測得該基因CDS區(qū)序列，為序列的分析提供了材料，此外，由于PCR擴增過程中選擇了高保真酶，減少了堿基的突變，增加了所得序列的可信度。將所測得的序列與NCBI上查找的豬GPS2基因預測序列比較，相似性達到97%。分析蛋白質(zhì)的一級結構并預測二級結構和三級結構，從預測結構來看，本研究所克隆的豬GPS2基因的CDS區(qū)序列可靠性較高，為進一步研究奠定了基礎，實驗最后部分對該基因進行了熒光定量PCR，長白豬是優(yōu)良的外來品種，生長速度快，脂肪沉積能力弱，但繁殖性能低下。因此，試驗以長白豬為實驗樣品，通過熒光定量PCR方法，研究GPS2基因在不同組織間的表達差異性。實驗結果顯示，GPS2基因在脂肪中的表達量顯著高于其他組織，因此初步推斷GPS2基因可能與豬的脂肪沉積有一定聯(lián)系，但由于目前GPS2基因在豬上的研究進展較少，并且，實驗目前仍只是局限于分子水平，不具備有力的實驗證據(jù)，因此，究竟GPS2基因是否與豬脂肪沉積有一定聯(lián)系，其中具體的機制又是如何，還需后期大量實驗的進一步探索。