王麗紅 閆勇杰 趙宏 宗希明 張?jiān)平?/p>

摘要：目的 對(duì)青龍衣中胡桃醌的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取料液比、超聲提取溫度和乙醇濃度為自變量，胡桃醌得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法對(duì)青龍衣中胡桃醌的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 胡桃醌最佳提取工藝為14.30倍量89.81%乙醇，30.28 ℃恒溫提取。胡桃醌得率為2.034 mg/g，與實(shí)測(cè)值1.957 mg/g偏差較小。結(jié)論 優(yōu)選的提取工藝合理可行，可為提取青龍衣中的胡桃醌提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：青龍衣；Box-Behnken響應(yīng)面法；核桃楸；胡桃醌；提取工藝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.016

中圖分類號(hào)：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）07-0067-04

Abstract： Objective To optimize extraction process of walnut quinone from Juglans green peel. Methods On the basis of single factor tests， taking material-liquid ratio， extracting temperature and ethanol concentration as independent variables， yield of walnut quinone in response to as a value， according to Box-Behnken experiment design principle， extraction process of walnut quinone from Juglans green peel was optimized by response surface analysis. Results The optimum extraction process of walnut quinone was： 14.30 times the amount of 89.81% ethanol； 30.28 ℃ constant temperature. The extracting amount of walnut quinone was 2.034 mg/g， which was close to the experimental results of 1.957 mg/g. Conclusion The optimized extraction process is reasonable and feasible， which can provide reference for the extraction of walnut quinone from Juglans green peel.

Keywords： Juglans green peel； Box-Behnken response surface methodology； Juglans mandshurica； walnut quinone； extraction process

核桃楸Juglans mandshurica Maxim.又名胡桃楸，為胡桃科胡桃屬落葉喬木，是我國(guó)珍貴木材樹(shù)種[1]。核桃楸樹(shù)皮、枝皮和果皮均可入藥，其未成熟外果皮又稱青龍衣。《中華本草》記載青龍衣“氣微，味微苦、澀。清熱燥濕，泄肝明目。主治濕熱下痢，帶下黃稠，目赤腫痛，麥粒腫，迎風(fēng)流淚，骨結(jié)核”[2]。青龍衣具有清熱、解毒、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等功效[3]，主要含有多糖類、醌類、黃酮類及大量鞣質(zhì)等化學(xué)成分，胡桃醌為青龍衣抗腫瘤的主要成分。1973年，Ota A等[4]從野核桃新鮮青皮中分離提純出5，8-二羥基-l，4萘醌，得出青龍衣中存在萘醌的結(jié)論，至今萘醌及其衍生物已成為各地學(xué)者的研究重點(diǎn)[5]。

國(guó)內(nèi)已有學(xué)者采用HPLC和紫外分光光度法對(duì)核桃楸青果皮、樹(shù)皮和樹(shù)葉中胡桃醌提取工藝進(jìn)行研究，試驗(yàn)方法均為單因素和正交試驗(yàn)[6-9]。由于未對(duì)單因素選擇進(jìn)行優(yōu)化且考察因素較少、正交試驗(yàn)只能處理離散型數(shù)據(jù)等缺陷，得出的提取工藝中各因素水平數(shù)值不夠精確。本研究在單因素試驗(yàn)優(yōu)化基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)選青龍衣中胡桃醌的最優(yōu)提取工藝。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 Series HPLC色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），BP211D型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司），F(xiàn)A2004電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司），KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），80-2臺(tái)式低速離心機(jī)（上海亞榮生化儀器廠），SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

胡桃醌對(duì)照品（純度≥98%，河南省標(biāo)物生物科技有限公司，批號(hào)16081201），色譜純甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），其余試劑均為分析純。

試驗(yàn)用材料于2016年9月21日采自黑龍江省湯原縣鷹山，經(jīng)佳木斯大學(xué)王麗紅教授鑒定為胡桃科胡桃屬核桃楸Juglans mandshurica Maxim.的果實(shí)，果皮剝下后陰干[10]，粉碎后過(guò)孔徑0.25 mm網(wǎng)篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)

取胡桃醌對(duì)照品溶液適量，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)0～800 nm掃描，得248 nm為胡桃醌紫外最大吸收波長(zhǎng)，故選擇該波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2 分離條件

依據(jù)文獻(xiàn)[11]，HPLC測(cè)定胡桃醌含量時(shí)，流動(dòng)相為甲醇-水（55∶45）且水相用磷酸（約0.1%）調(diào)pH值為3.30～3.80時(shí)胡桃醌分離峰形最佳。

2.1.3 色譜條件的確定

采用Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（55∶45），水相用磷酸（約0.1%）調(diào)pH值為3.60，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量10 μL[12]。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取胡桃醌對(duì)照品5.09 mg，用甲醇定容到25 mL容量瓶中，得胡桃醌對(duì)照品母液。精密移取該對(duì)照品母液0.25、0.5、1.25、2.5、5、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得濃度分別為5.09、10.18、25.45、50.9、101.8、203.6 μg/mL的對(duì)照品溶液。進(jìn)樣前用0.45 μm微孔膜過(guò)濾，取濾液進(jìn)行HPLC分析[13]。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取青龍衣粉末2.00 g，置于100 mL錐形瓶中，加無(wú)水乙醇30 mL，25 ℃超聲提取40 min，過(guò)濾，3500 r/min離心15 min，取上清液定容到10 mL容量瓶中。進(jìn)樣前用0.45 μm微孔膜過(guò)濾，取濾液進(jìn)行HPLC分析。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依次取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各10 μL進(jìn)樣，以胡桃醌濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=38.10X-172.6，r=0.999 5，表明胡桃醌在5.09～203.6 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

取低、中、高濃度（23.11、42.98、124.87 μg/mL）樣品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果RSD分別為1.52%、1.79%、1.34%。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將供試品溶液在一定時(shí)間內(nèi)按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定胡桃醌含量。結(jié)果室溫放置12 h內(nèi)檢測(cè)，胡桃醌含量穩(wěn)定；12～24 h檢測(cè)，胡桃醌含量略有下降；2 d后檢測(cè)，胡桃醌分解。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一次采集的青龍衣，按上述方法制備5份供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣，測(cè)定胡桃醌含量。結(jié)果胡桃醌平均含量為0.16%，RSD=1.53%。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量供試品溶液6份，每份4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，依次加入1、2、3、4、5、6 mL對(duì)照品溶液（濃度20 μg/mL），并用無(wú)水乙醇分別定容至刻度，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果平均回收率為96.74%，RSD=1.73%。

2.7 單因素試驗(yàn)考察

精密稱取青龍衣粉末2.00 g，通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察超聲提取時(shí)間（10～40 min）、提取溫度（20～35 ℃）、料液比（1∶10～1∶20）、乙醇濃度（80%～100%）對(duì)胡桃醌得率的影響。

2.7.1 提取時(shí)間

設(shè)定提取溫度30 ℃、料液比1∶15、乙醇濃度100%，考察提取時(shí)間10、20、30、40、50 min對(duì)胡桃醌得率的影響，結(jié)果依次為1.526、1.695、1.848、1.930、1.924 mg/g。表明胡桃醌得率呈先升高后降低趨勢(shì)，且在40 min達(dá)到最大，故提取時(shí)間以40 min為宜。

2.7.2 提取溫度

設(shè)定提取時(shí)間40 min、料液比1∶15、乙醇濃度100%，考察提取溫度20、25、30、35 ℃對(duì)胡桃醌得率的影響，結(jié)果依次為1.617、1.689、1.943、1.821 mg/g。表明胡桃醌得率呈先升高后降低趨勢(shì)，且在30 ℃達(dá)到最大，故提取溫度以30 ℃為宜。

2.7.3 料液比

設(shè)定提取時(shí)間40 min、提取溫度30 ℃、乙醇濃度100 %，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20對(duì)胡桃醌得率的影響，結(jié)果依次為1.460、1.644、1.580 mg/g。表明胡桃醌得率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，且在料液比為1∶15達(dá)到最大，故料液比以1∶15為宜。

2.7.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)

設(shè)定提取時(shí)間40 min、提取溫度30 ℃、料液比1∶15，考察乙醇濃度80%、90%、95%、100%對(duì)胡桃醌得率的影響，結(jié)果依次為1.388、1.613、1.849、1.684 mg/g。表明胡桃醌得率呈先升高后降低趨勢(shì)，且乙醇濃度為95%最大，故乙醇濃度以95%為宜。

2.8 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)考察基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)組合原理，選取料液比、提取溫度、乙醇濃度為自變量，胡桃醌得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert7.1.3軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design-Expert7.1.3軟件對(duì)胡桃醌提取工藝各因素進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程Y=2.02-0.12A+0.033B-0.003 125C+0.021AB+0.039AC+0.062BC-0.44A2-0.25B2-0.13C2，該模型的方差分析見(jiàn)表3。結(jié)果表明建立的回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型R2=0.818 1，r=0.904 5，模型擬合度較好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)青龍衣中胡桃醌的提取工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，因素A、A2、B2和C2對(duì)胡桃醌得率有極顯著影響，因素B、C影響不顯著，交互項(xiàng)AB、AC、BC影響不顯著。

采用Design-Expert7.1.3軟件，根據(jù)擬合模型繪制青龍衣中胡桃醌含量響應(yīng)面的等高線圖與響應(yīng)面圖，可得到各參數(shù)范圍內(nèi)的極值及因素間相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，該回歸方程存在極大值，最大響應(yīng)值為2.034 mg/g。此時(shí)最優(yōu)工藝條件為：料液比1∶14.30，乙醇濃度89.81%，提取溫度30.28 ℃。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際考慮，將最佳提取工藝調(diào)整為提取時(shí)間40 min，提取溫度30.50 ℃，乙醇濃度89.80%，料液比1∶14.30。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱取青龍衣粉末3份，每份2 g，按優(yōu)選的提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果胡桃醌平均得率為1.957 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值相差較小，說(shuō)明采用響應(yīng)面法對(duì)青龍衣中胡桃醌的提取工藝進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 討論

我國(guó)地域遼闊，核桃楸樹(shù)種分布繁多，青龍衣資源豐富。研究發(fā)現(xiàn)，青龍衣治療胃痛及抗腫瘤等作用顯著，胡桃醌為其主要有效成分[14-15]。但胡桃醌不穩(wěn)定，易分解、揮發(fā)的特點(diǎn)使其開(kāi)發(fā)利用受到限制。隨著研究不斷深入，胡桃醌的提取工藝得到優(yōu)化。

本試驗(yàn)中，因超聲提取機(jī)械產(chǎn)熱會(huì)使水溫稍有升高，為防止胡桃醌受熱分解、揮發(fā)造成誤差，需不斷換水以保持水溫恒定。進(jìn)行HPLC含量測(cè)定時(shí)，需平行進(jìn)針以保證數(shù)據(jù)的可靠性。

在提取工藝方面，Box-Behnken響應(yīng)面分析法可克服正交試驗(yàn)只能處理離散型數(shù)據(jù)的缺陷，可連續(xù)對(duì)整個(gè)區(qū)域的各個(gè)水平進(jìn)行分析，極大程度優(yōu)化提取工藝。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)優(yōu)選的料液比、提取溫度、乙醇濃度各水平的多元回歸及二項(xiàng)擬合，建立胡桃醌得率與各因素的回歸方程，得出料液比、提取溫度及乙醇濃度的平方項(xiàng)對(duì)胡桃醌得率影響顯著，并最終確定了最佳提取工藝，為青龍衣的資源化利用提供了參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 肖培根.新編中藥志：第2卷[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：530- 533.

[2] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：第2卷[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：375-376.

[3] KRAJCI W M， LYNCH D L. The inhibition of various microorganisms by crude walnut hull extracts and juglone[J]. Microbios Lett， 1977，4（15）：175-181.

[4] OTA A， SIVALINGAM P M， LIN S， et al. Isolation of naphthazarin from walnut “onigurumi” and its inhibitory action on oxidative phosphorylation in mitochondria[J]. Toxicon，1973，11（3）：235- 241.

[5] 閆勇杰，王麗紅.2種青龍衣化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（24）：123-125，149.

[6] 馮遲，王舒雅，高俊，等.核桃楸青果皮中胡桃醌的提取工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，45（5）：340-342.

[7] 王文澤，劉洪章，劉淑英，等.核桃楸青果皮中胡桃醌的提取工藝研究[J].北方園藝，2013（15）：153-157.

[8] 孫墨瓏，宋湛謙，方桂珍.核桃楸總黃酮及胡桃醌含量測(cè)定[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2006，26（2）：93-95.

[9] 程力惠，黃曉文.核桃楸樹(shù)皮中胡桃醌提取方法及其工藝研究[J].亞熱帶植物科學(xué)，2010，39（4）：33-35.

[10] 季宇彬，陸婉，曲中原，等.不同干燥方法、貯藏年限及采收時(shí)間對(duì)青龍衣中胡桃醌的影響[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2009，24（2）：110-112.

[11] 曲中原，鄒翔，胡國(guó)軍，等.青龍衣中胡桃醌提取工藝研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2008，36（4）：30-32.

[12] 王文澤.核桃楸青龍衣中四種成分的研究[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

[13] 李福榮，史衛(wèi)鋒，程國(guó)量，等.HPLC法測(cè)定青龍衣中胡桃醌的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，4（12）：164-165，167.

[14] 李中原.青龍衣治療食管賁門癌120例臨床觀察[J].中醫(yī)藥信息， 1988，5（3）：31.

[15] 李巖，趙劍璞，王燕妮，等.胡桃醌含藥血清體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究[J].北京理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（5）：545-550.