劉曉惠 趙延欣 劉學源

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）23-3178-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.03

摘 要 目的：體外研究姜黃素對高糖培養(yǎng)下大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞C6中抑癌基因p53、E3泛素連接酶Siah-1和認知相關(guān)蛋白突觸素（Synaptophysin）表達的影響。方法：采用CCK-8法檢測10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L姜黃素在高糖培養(yǎng)下作用C6細胞24、48 h后的細胞存活率。采用Western blot法和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT- PCR）法檢測作用24 h后正常對照組（無任何處理）、高糖培養(yǎng)組和姜黃素低、高濃度組（高糖+10、30 μmol/L姜黃素）細胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白及mRNA的表達情況；另同法檢測高糖培養(yǎng)下小干擾RNA（siRNA）沉默C6細胞中p53基因后對Siah-1蛋白及mRNA表達的影響。結(jié)果：姜黃素在10～40 μmol/L濃度范圍內(nèi)對C6細胞存活率無明顯影響，大于40 μmol/L濃度后呈濃度依賴性降低細胞存活率。與正常對照組比較，高糖培養(yǎng)組C6細胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表達增強，Synaptophysin蛋白及mRNA表達減弱，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與高糖培養(yǎng)組比較，姜黃素低、高濃度組C6細胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表達減弱，Synaptophysin蛋白及mRNA表達增強，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。高糖培養(yǎng)下，沉默p53基因后的C6細胞中Siah-1蛋白及mRNA表達均明顯減弱（P<0.05）。結(jié)論：高糖條件下，姜黃素可通過下調(diào)C6細胞中p53、Siah-1表達，進而上調(diào)Synaptophysin表達。

關(guān)鍵詞 姜黃素；高糖；p53；大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞C6；突觸素

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of curcumin on the expression of tumor suppressor gene p53， E3 ligase Siah-1 and cognitive associated protein Synaptophysin in glioma cells C6 of rats cultured in high glucose. METHODS： CCK-8 assay was used to detect survival rate of C6 cells after treated with 10， 20， 30， 40， 50， 60， 70， 80， 90， 100 μmol/L curcumin for 24， 48 h under high glucose environment. Western blot method and RT-PCR method were adopted to detect the protein and mRNA expressions of p53， Siah-1 and Synaptophysin in C6 cells of normal control group （without any treatment）， high glucose treatment group， curcumin low-concentration and high-concentration groups （high glucose+10， 30 μmol/L curcumin） after cultured for 24 h. Same method was used to determine the effects of P53 gene of C6 cells on protein and mRNA expression of Siah-1 after transfected with siRNA under high glucose environment. RESULTS： Curcumin had no significant effect on the survival rate of C6 cells in the range of 10-40 μmol/L. The survival rate of C6 cells decreased significantly in a concentration-dependent manner when the concentration of curcumin was higher than 40 μmol/L. Compared with normal control group， the protein and mRNA expressions of p53 and Siah-1 in C6 cells were enhanced in high glucose treatment group， while the protein and mRNA expressions of Synaptophysin were decreased， with statistical significance （P<0.05）. Compared with high glucose treatment group， the protein and mRNA expressions of p53 and Siah-1 in C6 cells were decreased in curcumin low-concentration and high-concentration groups， while the protein and mRNA expressions of Synaptophysin were enhanced， with statistical significance （P<0.05）. Under treated with high glucose， the protein and mRNA expressions of Siah-1 in C6 cells were decreased significantly after silencing p53 gene （P<0.05）. CONCLUSIONS： Under high glucose environment， curcumin can up-regulate the expression of Synaptophysin in C6 cells by down-regulating the expression of p53 and Siah-1.

KEYWORDS Curcumin； High glucose； p53； Glioma cells C6 of rats； Synaptophysin

姜黃素（Curcumin）是一種相對分子量較小的酚類化合物，提取于姜科黃屬植物的根莖，是疏肝藥物郁金、姜黃、莪術(shù)中的主要活性成分。姜黃素具有抗腫瘤、抗炎、降血脂、降血糖的功效[1]，同時由于姜黃素含有阿魏酸鈉的活性成分，而后者在臨床上具有改善腦微循環(huán)、清除氧自由基、抗凋亡等作用，并且毒副作用小[2]，具有巨大的臨床應用潛力。

糖尿病是認知功能障礙發(fā)生的獨立危險因素之一，其與認知功能障礙的發(fā)展有關(guān)。據(jù)報道，在65歲以上的住院患者中，約有26%患有糖尿病[3]。流行病學研究[4-5]和生物學證據(jù)[6-8]支持老年糖尿病患者更容易患各種類型的癡呆癥[9]。同時動物實驗也表明，糖尿病可明顯減少海馬苔蘚纖維末梢和突觸小泡的數(shù)量，導致實驗動物的認知功能下降[10]。本研究將以大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞C6為研究對象，通過體外模擬高糖環(huán)境重點探究不同濃度姜黃素對C6細胞中抑癌基因p53、E3泛素連接酶Siah-1和突觸素（Synaptophysin）表達的影響，以期為改善糖尿病患者的認識功能障礙提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Genesys 10型紫外分光光度計、BB15型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；Microfuge 20R型高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；TE22型蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國GE公司）；聚丙烯酰胺垂直電泳系統(tǒng)（德國Biometra公司）；Elx800型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Tek 公司）；Licor Odyssey型雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國Li-Cor公司）；2720型聚合酶鏈式反應儀（美國ABI公司）。

1.2 藥品與試劑

姜黃素對照品（貨號：458-37-7，純度：98%）、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA）均購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素均購自美國Gibco公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒（日本Dojindo公司）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒和PrimeScript RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix試劑盒（北京普凱瑞生物科技有限公司）；兔抗Synaptophysin單克隆抗體（貨號：ab52636）、小鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體 （貨號：ab6276）、山羊抗Siah-1多克隆抗體（貨號：ab131442）和兔抗p53多克隆抗體（貨號：sc-5505）均購自美國Abcam公司；抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（美國Li-Cor公司）；磷酸酶抑制劑PhosStop（美國Sigma公司，貨號：P0044，純度：98%）、RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、20×磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、苯甲基磺酰氟 （PMSF）均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Tris緩沖液、甘氨酸、脫脂奶粉、無水乙醇、甲醇均購自上海生工生物有限公司；小干擾RNA（siRNA）委托上海領(lǐng)科生物有限公司構(gòu)建完成。

1.3 細胞

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞C6購于中國科學院上海生物化學和細胞生物學研究所。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)、分組與給藥

取C6細胞，以含1%雙抗（青霉素、鏈霉素）、10%FBS、25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)為正常對照組；以含1%雙抗（青霉素、鏈霉素）、10%FBS、50 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)為高糖培養(yǎng)組；取10 mg姜黃素溶于2.714 5 mL DMSO中得到濃度為10 mmol/L的母液，用培養(yǎng)基稀釋，加入到高糖培養(yǎng)3 d后的細胞培養(yǎng)皿中，使姜黃素終濃度分別達到10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L，分別作用24、48 h，設(shè)為姜黃素處理組。

2.2 CCK-8法檢測細胞存活率

按CCK-8細胞活性檢測試劑盒操作方法，檢測“2.1”項下不同濃度姜黃素處理組作用24、48 h后細胞的存活率，根據(jù)結(jié)果篩選出不影響細胞存活率的姜黃素濃度和作用時間。細胞存活率（%）=[給藥組吸光度（OD值）-空白組OD值]/（對照組OD值-空白組OD值）×100%，其中對照組中不加姜黃素，空白組中不加姜黃素和C6細胞。

2.3 Western blot法檢測細胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白表達

將10 μL PMSF 加入至1 mL RIPA裂解液中配制成蛋白裂解液，分別裂解抽提“2.1”項下正常對照組、高糖培養(yǎng)組和姜黃素低、高濃度組（10、30 μmol/L）作用24 h后細胞中的總蛋白，以二喹啉甲酸（BCA）試劑盒對蛋白濃度進行定量，得到不同樣品的蛋白濃度后按照1 ∶ 6的比例加入6×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照總蛋白量?0 μg計算上樣量，用移液槍將適量蛋白樣品加入上樣孔，成功上樣后將電泳儀調(diào)至恒壓80 V，待溴酚藍指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，電泳儀調(diào)至恒壓120 V，至溴酚藍指示劑到凝膠底部，轉(zhuǎn)膜，置于一抗孵育液[小鼠抗β-actin單克隆抗體（1 ∶ 1 000）、山羊抗Siah-1多克隆抗體（1 ∶ 500）、兔抗p53多克隆抗體（1 ∶ 1 000）、兔抗Synaptophysin單克隆抗體 （1 ∶ 500）]中4 ℃孵育過夜，再置于兔抗IgG（1 ∶ 1 000）孵育液中4 ℃下孵育1 h，顯色曝光后分析條帶灰度值，以目標條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

2.4 RT-PCR法檢測細胞中p53、Siah-1、Synaptophysin mRNA表達

采用Trizol法分別提取正常對照組、高糖培養(yǎng)組、姜黃素處理組（10、30 μmol/L）作用24 h后細胞的總RNA，將總RNA沉淀5～10 min，溶于20 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）水中。取溶解后的RNA 1 μL用DEPC水稀釋200倍后，紫外分光光度計測定其260、280 nm波長處的OD值，并計算OD260/OD280值，若OD260/OD280值在1.8～2.0之間表明滿足試驗要求。將總RNA放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩２捎?PrimeScript RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix試劑盒，將cDNA稀釋10倍后進行RT-PCR檢測，反應體系按說明書操作。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共進行 40個循環(huán)，結(jié)束后以mRNA的實時熒光強度的變化值為縱坐標繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔct進行分析。ΔΔct=Δct（試驗樣品）-Δct（基準樣品）；Δct（試驗樣品）=ct（試驗組目的基因數(shù)值）-ct（試驗組內(nèi)參基因數(shù)值）；Δct（基準樣品）=ct（對照組目的基因數(shù)值）-ct（對照組內(nèi)參基因數(shù)值）。按照引物設(shè)計的原則，應用Primer Premier 5.0 軟件，設(shè)計RT-PCR引物序列，該引物生成委托上海生工生物技術(shù)有限公司完成，引物序列見表1。

2.5 沉默p53對Siah-1的影響

試驗分為正常對照組、高糖培養(yǎng)組、正常siRNA干擾組和高糖siRNA干擾組。細胞培養(yǎng)方法同“2.1”；siRNA沉默p53基因方法：取對數(shù)生長期C6細胞，胰酶消化后接種于6孔板中，接種時細胞密度為2.5×104 cm-2，在細胞培養(yǎng)達到30%～50%匯合度時行siRNA轉(zhuǎn)染，沉默p53基因。按Western blot法和RT-PCR法分別檢測3組細胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表達。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計處理。計量資料用x±s表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。所有實驗均重復至少3次。

3 結(jié)果

3.1 細胞存活率

10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L姜黃素作用24 h后C6細胞存活率分別為（98.120±0.69）%、（97.144±2.35）%、（92.876±2.08）%、（92.530±1.57）%、（84.636±0.54）%、（66.587±1.38）%、（56.740±1.75）%、（23. 521±1.59）%、（3.046±1.18）%、（2.879±0.23）%，經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)P<0.05，表明作用24 h時姜黃素濃度對C6細胞存活率有影響；作用48 h后C6細胞存活率分別為（91.381±1.03）%、（86.739±2.82）%、（85.478± 2.34）%、（77.318±3.66）%、（62.085±0.71）%、（58.214± 1.26）%、（43.619±3.65）%、（19.104±2.85）%、（6.067±4.63）%、（2.100±0.251）%，經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)P<0.05，表明作用48 h時姜黃素濃度對C6細胞存活率有影響。上述結(jié)果可以看出，姜黃素濃度為10～40 μmol/L時不會顯著降低C6細胞存活率，濃度大于40 μmol/L時，隨著作用濃度的升高，C6細胞存活率隨之降低，呈劑量依賴性；同時藥物作用時間24 h優(yōu)于48 h。不同濃度姜黃素對細胞存活率的影響見圖1。

3.2 細胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白表達

與正常對照組比較，高糖培養(yǎng)組細胞中p53、Siah-1蛋白表達明顯增強，Synaptophysin蛋白表達明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與高糖培養(yǎng)組比較，姜黃素低、高濃度組細胞中p53、Siah-1蛋白表達明顯減弱，Synaptophysin蛋白表達明顯增強，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組細胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結(jié)果見圖3。

3.3 細胞中p53、Siah-1、Synaptophysin mRNA表達

與正常對照組比較，高糖培養(yǎng)組細胞中p53、Siah-1 mRNA表達明顯增強，Synaptophysin mRNA表達明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與高糖培養(yǎng)組比較，姜黃素低、高濃度組細胞中p53、Siah-1 mRNA表達明顯減弱，Synaptophysin mRNA表達明顯增強，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組細胞中p53、Siah-1、Synaptophysin mRNA表達的測定結(jié)果見圖4。

3.4 siRNA沉默p53基因后對Siah-1的影響

3.4.1 正常培養(yǎng) 與正常對照組比較，正常siRNA干擾組細胞中p53 蛋白和mRNA表達均明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示siRNA干擾組成功沉默p53基因。正常條件下siRNA干擾后細胞中p53蛋白表達的電泳圖見圖5，p53蛋白及mRNA表達的測定結(jié)果見圖6。

3.4.2 高糖培養(yǎng) 與正常對照組比較，高糖培養(yǎng)組細胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表達均明顯增強（P<0.05）。與高糖培養(yǎng)組比較，高糖siRNA干擾組細胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表達均明顯減弱（P<0.05）。提示沉默p53基因可明顯抑制高糖培養(yǎng)下C6細胞中Siah-1蛋白及mRNA表達的增強。高糖條件下siRNA干擾后細胞中p53、Siah-1蛋白表達的電泳圖見圖7，p53、Siah-1蛋白及mRNA表達的測定結(jié)果見圖8。

4 討論

Synaptophysin是突觸小泡中的主要蛋白質(zhì)，在整個大腦的神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中普遍存在，并被證明與認知功能密切相關(guān)[11]。突觸傳遞過程是認知功能表達的重要環(huán)節(jié)，Synaptophysin作為突觸的特異性標記，已有研究證實其參與了神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸可塑性、突觸小泡形成以及再利用的過程，涉及學習、記憶等認知方面[12-13]，同時在糖尿病認知功能障礙的動物模型中可以觀察Synaptophysin的表達下降[14]。研究表明，Siah-1是降解Synaptophysin的主要蛋白酶，在神經(jīng)元中主要通過泛素-蛋白酶體途徑進行降解[15]。

在本研究中，筆者體外模擬高血糖癥模型培養(yǎng)大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞C6，探討高糖條件下姜黃素對認知保護蛋白Synaptophysin的調(diào)節(jié)作用，并探討了其相關(guān)作用機制。筆者將姜黃素配制成10～100 μmol/L的溶液，分別加入到高糖培養(yǎng)3 d后的C6細胞模型中，分別作用24、48 h，采用CCK-8細胞活性檢測試劑盒檢測細胞活性。結(jié)果顯示，姜黃素濃度為10～40 μmol/L時不會顯著降低細胞存活率，同時藥物作用時間24 h優(yōu)于48 h，所以后續(xù)試驗選取了10、30 μmol/L作為姜黃素的實驗濃度，24 h作為作用時間。這一結(jié)果說明姜黃素的藥物濃度在較小的一定范圍內(nèi)不會對細胞活性造成損傷，但超過一定的濃度范圍，會顯著降低細胞存活率，對細胞活性造成損傷。相同藥物濃度下作用48 h后的細胞存活率依次低于作用24 h的細胞存活率，表明藥物作用時間越長對細胞存活率損傷越大。通過對p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白和mRNA表達水平的檢測結(jié)果提示，高糖培養(yǎng)3 d后細胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表達均明顯增強，同時Synaptophysin蛋白和mRNA表達均明顯減弱；之后姜黃素作用24 h后細胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表達均明顯減弱，同時Synaptophysin蛋白和mRNA表達均明顯增強。為了進一步研究姜黃素是否是通過調(diào)控p53、Siah-1進而上調(diào)Synaptophysin的，本文還構(gòu)建了p53基因沉默C6細胞，結(jié)果顯示，高糖siRNA干擾組細胞中Siah-1基因也隨之下調(diào)，提示高糖條件誘導沉默p53可抑制Siah-1上調(diào)，進而介導泛素化降解Synaptophysin，使Synaptophysin表達上調(diào)。

綜上所述，高糖條件下，姜黃素可通過下調(diào)C6細胞中p53、Siah-1表達，進而上調(diào)Synaptophysin表達。

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（收稿日期：2018-05-23 修回日期：2018-10-17）

（編輯：鄒麗娟）