孫子奎

摘 要：本文首先介紹現(xiàn)有的三代測(cè)序技術(shù)的內(nèi)容、方法、原理等；其次，分析和研究了不同測(cè)序技術(shù)在生育健康、腫瘤診斷與治療、用藥指導(dǎo)等健康醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，育種領(lǐng)域及環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用；最后，結(jié)合政策紅利不斷持續(xù)及市場(chǎng)需求大幅增加等因素，展望測(cè)序技術(shù)在未來(lái)各領(lǐng)域的應(yīng)用需求前景廣闊。

細(xì)胞是生命體最基本的結(jié)構(gòu)單位和功能單位，所有的細(xì)胞都含有兩種核酸： 即DNA與RNA。核酸是一種大分子化合物，由核苷酸聚合而成，是生命體存在的基礎(chǔ)，生命體內(nèi)的核酸具有易于蛋白質(zhì)結(jié)合的特性，以核蛋白的形式存在。基于化學(xué)組成，可將核酸分為核糖核酸和脫氧核糖核酸，即DNA和RNA。DNA主要作為儲(chǔ)存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的介質(zhì)。RNA又分為tRNA、mRNA和rRNA，其中tRNA，即轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸，主要通過(guò)攜帶和轉(zhuǎn)移活化氨基酸的方式，作為核糖核酸的搬運(yùn)工，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。mRNA又稱為信使核糖核酸，是蛋白質(zhì)合成的模板；rRNA，即核糖體的核糖核酸，主要作為蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所。

快速準(zhǔn)確獲取細(xì)胞中的核酸信息或基因組遺傳信息在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要性不言而喻。自上個(gè)世紀(jì)70年代第一代測(cè)序平臺(tái)的發(fā)展、成熟，到如今的第二代高通量測(cè)序平臺(tái)和第三代單分子測(cè)序平臺(tái)快速占領(lǐng)基因測(cè)序市場(chǎng)。本文將根據(jù)第一、二、三代測(cè)序技術(shù)的不同發(fā)展階段，結(jié)合不同測(cè)序技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用情況，研究不同測(cè)序技術(shù)在各領(lǐng)域的應(yīng)用。

一、測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介

（一）第一代測(cè)序技術(shù)

第一代測(cè)序技術(shù)以桑格（ Sanger）等的雙脫氧測(cè)序技術(shù)為代表，并引領(lǐng)市場(chǎng)30年。其原理是以DNA單鏈為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增、電泳分離、激光誘導(dǎo)熒光顏色區(qū)分及信息轉(zhuǎn)換等一系列的操作步驟后，獲得長(zhǎng)度為1000堿基的組成序列。第一代測(cè)序技術(shù)廣泛應(yīng)用于PCR產(chǎn)物、載體克隆測(cè)序等方面，具有讀長(zhǎng)達(dá)1000bp、準(zhǔn)確性高達(dá)99.99%等特點(diǎn)，但第一代測(cè)序技術(shù)通量低、成本高的缺點(diǎn)，也限制了其在很多領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用，同時(shí)也激發(fā)了眾多科學(xué)研究者尋找新一代測(cè)序技術(shù)的研究浪潮。

（二）第二代測(cè)序技術(shù)

在市場(chǎng)需求及技術(shù)創(chuàng)新的雙重推動(dòng)下，兼具高通量、低成本等優(yōu)點(diǎn)的第二代測(cè)序技術(shù)誕生。第二代高通量測(cè)序技術(shù)為深度測(cè)序（deep sequencing）或下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）。第二代高通量測(cè)序技術(shù)的原理是直接通過(guò)聚合酶或連接酶的作用，進(jìn)行體外測(cè)序，而無(wú)須進(jìn)行體內(nèi)擴(kuò)增。

1、聚合酶合成測(cè)序法

目前，行業(yè)內(nèi)從事高通量基因測(cè)序的公司，基本均與Illumina公司保持合作關(guān)系，采用其Solexa和Hiseq設(shè)備。聚合酶合成測(cè)序法是以特有的可逆終止化學(xué)反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對(duì)被隨機(jī)打斷的基因組DNA片段構(gòu)建文庫(kù)，經(jīng)過(guò)延伸和擴(kuò)增，進(jìn)行邊合成邊測(cè)序。

2、連接酶合成測(cè)序法

連接酶合成測(cè)序法，即Solid測(cè)序，其原理是應(yīng)用雙堿基編碼技術(shù)，增加堿基被閱讀次數(shù)，降低測(cè)序過(guò)程錯(cuò)誤比率，便于方便區(qū)分SNP和測(cè)序錯(cuò)誤，并利用DNA連接酶在連接過(guò)程之中測(cè)序，在測(cè)序過(guò)程中，儀器自動(dòng)加入4種熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，促使其與引物發(fā)生連接反應(yīng)、激發(fā)熒光標(biāo)記的方式，識(shí)別堿基類型。

第二代測(cè)序技術(shù)在保持第一代測(cè)序高準(zhǔn)確性的同時(shí)，大幅提高了測(cè)序效率，并降低了測(cè)序的成本，但其也存在讀長(zhǎng)較第一代測(cè)序短的不足。

（三）第三代測(cè)序技術(shù)

第三代測(cè)序技術(shù)，即單分子測(cè)序技術(shù)，以SMRT和新型納米孔測(cè)序技術(shù)為代表。具有無(wú)需PCR擴(kuò)增、讀長(zhǎng)較長(zhǎng)、CCS模式提高準(zhǔn)確率、測(cè)序無(wú)堿基偏好性，堿基讀取無(wú)系統(tǒng)偏差，能直接讀取堿基修飾等特點(diǎn)。

SMRT測(cè)序技術(shù)采用熒光標(biāo)記脫氧核苷酸，用顯微鏡實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化的方式進(jìn)行。當(dāng)被標(biāo)記的脫氧核苷酸混入DNA鏈時(shí)，DNA鏈上就能探測(cè)到該熒光。當(dāng)被熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸與DNA鏈形成化學(xué)鍵時(shí)，DNA聚合酶將切除該熒光基團(tuán)。在此過(guò)程中，DNA聚合酶的活性不受熒光標(biāo)記物影響。因此，熒光基團(tuán)被切除后，能產(chǎn)生與天然DNA鏈完全一樣的合成的DNA鏈。

新型納米孔測(cè)序法的實(shí)驗(yàn)原理是依據(jù)ATCG單個(gè)堿基具有的不同帶電性質(zhì)，采用電泳技術(shù)，通過(guò)信號(hào)差異促使不同的單個(gè)堿基逐一通過(guò)直徑非常細(xì)小的納米孔的方式實(shí)現(xiàn)測(cè)序。

二、測(cè)序技術(shù)在各領(lǐng)域的應(yīng)用。

（一）測(cè)序技術(shù)在健康領(lǐng)域的應(yīng)用

各種疾病的產(chǎn)生，均與基因序列的異變有著密不可分的關(guān)系?；驕y(cè)序即在分子水平通過(guò)對(duì)基因序列進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)定，從而提供早期篩查和治療建議的一種生物科技技術(shù)。隨著科學(xué)研究的不斷深入，測(cè)序技術(shù)不斷演進(jìn)，人們對(duì)眾多基因的結(jié)構(gòu)和功能更加了解，加速了測(cè)序技術(shù)在生育健康領(lǐng)域（含親子檢測(cè)）、腫瘤診斷治療領(lǐng)域、以高血壓、糖尿病為代表的慢病、遺傳性疾病、乙肝基因檢測(cè)等多種疾病的臨床用藥指導(dǎo)領(lǐng)域內(nèi)的廣泛應(yīng)用。

1、生育健康領(lǐng)域

市場(chǎng)需求助力測(cè)序技術(shù)在生育健康領(lǐng)域的應(yīng)用。一方面，二胎政策放開(kāi)、高齡產(chǎn)婦數(shù)量增加，將大幅增加孕后產(chǎn)前篩查和新生兒疾病檢測(cè)的需求。另一方面，由于環(huán)境污染等各種因素的影響，我國(guó)不孕不育率逐年上升，這也將加速試管嬰兒胚胎植入前的測(cè)序需求。

測(cè)序技術(shù)可以通過(guò)遺傳咨詢方式，基于測(cè)序結(jié)果，結(jié)合疾病的不同遺傳模式進(jìn)行生育指導(dǎo)。通過(guò)孕后產(chǎn)前診斷技術(shù)、試管嬰兒胚胎植入前篩查等技術(shù)，檢查胎兒的基因序列，進(jìn)而判斷其健康狀況，提高新生寶寶的健康率。無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）是基因測(cè)序所應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)化程度較高的生育健康市場(chǎng)細(xì)分領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的孕后產(chǎn)前臨床檢測(cè)技術(shù)相比，NIPT具有安全性好、準(zhǔn)確率高、周期短等優(yōu)勢(shì)。

2、腫瘤診斷治療領(lǐng)域

國(guó)家癌癥中心2017年公布的我國(guó)腫瘤發(fā)病率和死亡率的現(xiàn)狀和趨勢(shì)數(shù)據(jù)顯示，目前肺癌、胃癌、肝癌、食管癌和結(jié)直腸癌位居我國(guó)腫瘤發(fā)病前五位。其中，肺癌的高致死性多發(fā)生在男性患者群體中，而乳腺癌在女性患者中則高居榜首。目前，C：＼Users＼Administrator＼Desktop＼50019265414022609_？-？？-？？￥？_？μ？è°？？μ？？o？？？？？？ˉ？？¨？？？？？aé￠？？？？？？？？o？？？¨pp＼PaperPass-？？？è？°？？？-？￡？？μ？？？￥？？？＼htmls＼sentence_detail＼75.html肺癌、胃癌、肝癌、食管癌和結(jié)直腸癌位居我國(guó)腫瘤死亡前五位。綜合來(lái)看，肺癌居發(fā)病率和死因率均居榜首。預(yù)防難、發(fā)現(xiàn)晚和難治療是我國(guó)腫瘤防控的難點(diǎn)。面對(duì)結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌等腫瘤的發(fā)病及死亡率均居前列的嚴(yán)峻形勢(shì)，結(jié)合基因測(cè)序具有早期篩查疾病發(fā)生、精準(zhǔn)定位差異信息并指導(dǎo)精準(zhǔn)、安全用藥、輔助臨床診斷治療等作用。因此，通過(guò)基因測(cè)序手段進(jìn)行癌癥的早期篩查、診斷、治療就顯得至關(guān)重要。

目前，基于特定突變，通過(guò)對(duì)血液樣本DNA進(jìn)行分析的方式確定腫瘤存在并能指導(dǎo)干預(yù)治療的液體活檢技術(shù)備受科學(xué)研究者的關(guān)注，未來(lái)液體活檢檢查必將像當(dāng)前市場(chǎng)上的Pap涂片和結(jié)腸鏡檢查一樣，成為癌癥篩查的重要工具。此外，部分慢病如糖尿病、高血壓、心腦血管等疾病的發(fā)生與基因表達(dá)有著密切的聯(lián)系，利用基因測(cè)序技術(shù)能通過(guò)連鎖分析等手段尋找對(duì)應(yīng)基因、鑒定基因功能等方式，鎖定疾病相關(guān)基因，確定提前預(yù)知疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，并能針對(duì)基因差異性情況，提供個(gè)性化的預(yù)防、診斷、治療及健康管理方案。

3、用藥指導(dǎo)領(lǐng)域

基因檢測(cè)用于臨床用藥指導(dǎo)的原理是基于患者體內(nèi)影響藥物代謝的酶的差異，通過(guò)基因檢測(cè)結(jié)果，分析其代謝水平，進(jìn)而了解其對(duì)藥物反應(yīng)相關(guān)的基因是否存在異變，從而判斷其對(duì)藥物的不良反應(yīng)程度，輔助醫(yī)生在藥品選擇、劑量控制及聯(lián)合用藥等方面提供精準(zhǔn)、個(gè)性化的用藥方案，確保精準(zhǔn)用藥的同時(shí)，降低過(guò)度攝入藥物的毒副作用。

（二）農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域

高通量測(cè)序技術(shù)低成本的特性、可擁有參考基因組序列物種的增多、以及全基因組從頭測(cè)序和深度重測(cè)序、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、遺傳差異及連鎖分析、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄組分析等方法的不斷推出，為新品種選育、品質(zhì)改良提供了前所未有的方案，縮短了新品種的育種周期，加速了高通量測(cè)序技術(shù)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域的充分應(yīng)用。在全基因組水平上掃描并檢測(cè)相關(guān)重要位點(diǎn)，對(duì)育種領(lǐng)域的研究具有極大的科研與產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

（三）環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域

1、土壤保護(hù)領(lǐng)域

土壤微生物種類繁多，約達(dá)數(shù)萬(wàn)種，在土壤生態(tài)系統(tǒng)扮演著舉足輕重的角色。通過(guò)多種不同代謝方式和生理功能實(shí)現(xiàn)的微生物的功能多樣性是評(píng)價(jià)土壤變化原因的重要指示因子。

基于高通量測(cè)序技術(shù)通量較高的特點(diǎn)，土壤微生物在物種、結(jié)構(gòu)、功能和遺傳多樣性等領(lǐng)域的研究?jī)?nèi)容及信息更加豐富。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)土壤中微生物細(xì)胞內(nèi)特定遺傳物質(zhì)的保守序列中可變區(qū)域的測(cè)定和比對(duì)，可分析探究土壤微生物物種和群落結(jié)構(gòu)的多樣性特征。

2、污水治理領(lǐng)域

隨著我國(guó)工業(yè)化水平的不斷提高，工業(yè)廢水已成為污水排放比的主要排放源，占我國(guó)工業(yè)污水排放總量的比例超過(guò)1/3以上。同時(shí)，由于多數(shù)企業(yè)無(wú)證排污、偷排和超排情況嚴(yán)重，排放量大、達(dá)標(biāo)率低、回用率低是我國(guó)污水治理面臨的重要現(xiàn)狀。

通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)污水中的菌群的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，配合采用生物菌劑及微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)制劑作為添加劑等方式，增強(qiáng)有利細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，加速增殖，促使高效氧化分解毒性污染物，提高系統(tǒng)抗沖擊性和穩(wěn)定性，以較低的運(yùn)行成本、高效的處理效率、較低的管理難度進(jìn)行污水治理。

三、展望

政府支持和鼓勵(lì)以基因測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的精準(zhǔn)醫(yī)療行業(yè)迎來(lái)政策紅利。2015年，《關(guān)于產(chǎn)前診斷機(jī)構(gòu)開(kāi)展高通量基因測(cè)序產(chǎn)前篩查與診斷臨床應(yīng)用試點(diǎn)工作的通知》和《關(guān)于開(kāi)展高通量基因測(cè)序技術(shù)臨床應(yīng)用試點(diǎn)工作的通知》相繼出臺(tái)，審批通過(guò)百余家醫(yī)療機(jī)構(gòu)作為高通量基因測(cè)序NIPT臨床試點(diǎn)單位，從國(guó)家層面肯定高通量測(cè)序技術(shù)在臨床檢測(cè)中的重要作用。2016年，《關(guān)于發(fā)布國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)專項(xiàng)2016年度項(xiàng)目申報(bào)指南的通知》頒布，將精準(zhǔn)醫(yī)療列為2016年優(yōu)先啟動(dòng)的重點(diǎn)專項(xiàng)之一。2017年，地球生物基因組計(jì)劃（EBP）正式提出，對(duì)地球上所有真核生物進(jìn)行測(cè)序。地球物種基因組計(jì)劃的啟動(dòng)、實(shí)施得益于基因測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，同時(shí)也能推進(jìn)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，提高技術(shù)人員的能力，進(jìn)而促進(jìn)基因測(cè)序行業(yè)的爆發(fā)式發(fā)展。

政策持續(xù)利好、產(chǎn)業(yè)潛在需求巨大、測(cè)序技術(shù)的不斷更新將加速基因測(cè)序在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用推廣。利用高通量二代和三代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)基因的細(xì)微差異；利用一代基因測(cè)序的精確度，深入探究微生物演進(jìn)。相信未來(lái)，基因測(cè)序技術(shù)能為人類的健康和疾病預(yù)防和治療和地球的生態(tài)平衡等帶來(lái)質(zhì)的飛躍。

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