馬云艷

摘要：根據《中國藥典》2015年版四部通則1105及1106非無菌產品微生物限度檢查方法要求，建立鹽酸丙卡特羅微生物限度檢查方法。方法采用加入沖洗液及薄膜過濾以消除抑菌性。結果表明各試驗菌的回收比值均在0.5～2之間，控制菌結果呈陽性。表明該方法可作為鹽酸丙卡特羅的常規(guī)微生物限度檢查方法。

關鍵詞：鹽酸丙卡特羅；薄膜過濾

鹽酸丙卡特羅屬于選擇性β2受體激動劑，對支氣管的β2受體具有高度選擇性，其支氣管擴張作用強而持久。本文討論其作為口服制劑的原料藥使用，根據《中國藥典》2015年版四部通則1105及1106非無菌產品微生物限度檢查方法要求，應進行需氧菌、霉菌及酵母菌總數(shù)測定及大腸埃希菌控制菌檢查，本次試驗對鹽酸丙卡特羅的需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)及控制菌檢查分別進行討論。

1 儀器與試驗用品

1.1 試驗菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]

枯草芽孢桿菌[CMCC（B） 63501]

銅綠假單胞菌[CMCC（B） 10104]

白色念珠菌 [CMCC（F） 98001]

黑曲霉[CMCC（F） 98003]

1.2 培養(yǎng)基、稀釋液、沖洗液等

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

氯化鈉

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基

麥康凱液體培養(yǎng)基

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基

聚山梨酯80

1.3儀器

生化培養(yǎng)箱

立式壓力蒸汽滅菌器

電熱恒溫鼓風干燥箱

Milliflex PLUS微生物過濾系統(tǒng)

1.4 樣品

鹽酸丙卡特羅

2微生物限度方法驗證試驗

2.1菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，30～35℃培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)2～3天，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出轉移至空無菌試管作為原菌液，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2供試液的制備

取本品10g，加含0.1%聚山梨酯80的PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，混勻，作為1：10供試液。

2.3 需氧菌總數(shù)測定方法試驗

2.3.1 平皿法

（1）試驗組：取1：10供試液9.9ml，加入適量濃度的0.1ml枯草芽孢桿菌菌液，制成菌含量<100cfu/ml的供試液，取0.1ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。同法制備含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的供試液，備用。

（2）菌液組：取適量濃度的0.1ml枯草芽孢桿菌菌液加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至10ml，混勻，制成菌含量<100cfu/ml的菌懸液，吸取0.1ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。同法制備含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液，備用。

（3）供試品對照組：取試驗組項下1：10供試液0.1ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。

2.3.2結論

通過培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌回收比值小于0.5，說明本品對枯草芽孢桿菌有抑制作用，故不采用該法。

2.3.3 薄膜過濾法

（1）試驗組：采用薄膜過濾法，先用少量pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕濾膜，取1：10供試液1ml，加至100ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，再加入菌含量<100cfu/ml的枯草芽孢桿菌菌液，混勻后，全量倒入Milliflex PLUS微生物過濾系統(tǒng)的Microfil泵頭上的250ml濾杯內，抽濾完全，將濾膜用鑷子取下貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上。同法操作并依次加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。

（2）菌液組：取相應稀釋液替代供試液，同試驗組操作。按規(guī)定溫度培養(yǎng)并計數(shù)。

（3）供試品對照組：取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，同試驗組操作。

（4） 陰性對照組：取相應稀釋液替代供試液，不加菌液，同試驗組操作。

2.4霉菌及酵母菌總數(shù)測定試驗

（1）試驗組：取1：10供試液9.9ml，加入適量濃度的0.1ml白色念珠菌菌液，制成菌含量<100cfu/ml的供試液，取1ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。同法制備含黑曲霉的供試液，備用。

（2）菌液組：取適量濃度的0.1ml白色念珠菌菌液加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至10ml，制成菌含量<100cfu/ml的菌懸液，吸取1ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。同法制備含黑曲霉的菌懸液，備用。

（3）供試品對照組：取需氧菌試驗組項下1：10供試液1ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

2.5 結果

通過三次試驗結果表明，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液組菌落數(shù)的比值均在0.5～2范圍內，各試驗菌的回收試驗均符合《中國藥典》2015年版中的規(guī)定，可照所用的供試液制備方法和計數(shù)法進行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母總數(shù)計數(shù)。

3 控制菌檢查方法驗證試驗

3.1試驗菌種：

大腸埃希菌[CMCC（B） 44102]

3.2菌液制備：

取大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)約為不大于100cfu的菌懸液。

3.3 驗證方法

（1）試驗組：取1：10的供試液10ml和規(guī)定量大腸埃希菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時。

（2）陽性對照組：取規(guī)定量的大腸埃希菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24小時。

（3）陰性對照組：陰性對照組：取10ml稀釋液加入100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時。

（4）取試驗組、陽性對照組、陰性對照組上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。

3.4結果

通過三次試驗表明，陽性對照組檢出大腸埃希菌；試驗組檢出大腸埃希菌，陰性對照組未檢出大腸埃希菌。結果符合《中國藥典》2015年版中的規(guī)定，方法可行，可照該方法進行大腸埃希菌控制菌試驗。

4 討論

鹽酸丙卡特羅微生物限度方法驗證中，需氧菌總數(shù)測定采用平皿法，對枯草芽孢桿菌有抑菌性，故加入沖洗液并采用薄膜過濾法進行試驗，而霉菌及酵母菌總數(shù)測定中供試品對白色念珠菌、黑曲霉無抑菌性，故采用平皿法進行試驗。取1：10供試液10ml至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，進行控制菌（大腸埃希菌）檢查。