長(zhǎng)春理工大學(xué) 國(guó)家納米操縱與制造國(guó)際聯(lián)合研究中心 程利群 曲英敏 楊煥洲 孫佰順

導(dǎo)語(yǔ)：AFM因具有很高的空間分辨率和力學(xué)靈敏度，并可在空氣、真空和溶液中檢測(cè)生物細(xì)胞的表面形貌和力學(xué)特性，近年來(lái)已取得了迅速發(fā)展并獲得廣泛應(yīng)用。本文主要介紹AFM的基本結(jié)構(gòu)、工作原理以及在生命科學(xué)中應(yīng)用和系統(tǒng)改進(jìn)的一些研究進(jìn)展。

1.引言

原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope——AFM）于1986年由格爾德·賓尼（G．Binning）等人在掃描隧道顯微鏡的基礎(chǔ)上發(fā)明的①。AFM通過檢測(cè)探針針尖與樣品表面之間極微弱的原子和分子間的相互作用力來(lái)檢測(cè)樣品的表面形貌和結(jié)構(gòu)，具有很高的空間分辨率（納米級(jí)）②。AFM不僅能夠提供樣品表面的三維高空間分辨圖像，還能夠測(cè)量探針針尖與樣品原子間的極微弱的力（pN級(jí)），給出樣品的力譜曲線。AFM樣品不需要導(dǎo)電，測(cè)量環(huán)境要求低，不需要高真空，可以在常溫、低溫、高溫、大氣、溶液中使用，因此，成為生命科學(xué)研究細(xì)胞的一種有力的工具。近年來(lái)，隨著AFM技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步以及AFM與光學(xué)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等其它技術(shù)相結(jié)合的聯(lián)合使用，使得AFM的功能進(jìn)一步擴(kuò)展，AFM已在生命科學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。

2.AFM的基本結(jié)構(gòu)和原理

AFM主要由力檢測(cè)、位置檢測(cè)和信息控制處理三個(gè)部分組成③，其基本結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 AFM的基本結(jié)構(gòu)

力檢測(cè)部分主要由探針架、微米尺度的微懸臂和曲率半徑為納米量級(jí)的探針組成，力檢測(cè)部分是AFM的關(guān)鍵組成部分。

位置檢測(cè)部分由步進(jìn)電機(jī)、壓電陶瓷、激光器和光電探測(cè)器構(gòu)成，其作用是控制樣品表面與探針針尖之間保持一定距離。當(dāng)探針針尖與樣品之間產(chǎn)生相互作用時(shí)，會(huì)使與針尖連接的對(duì)微弱力極敏感的微懸臂產(chǎn)生移動(dòng)，此時(shí)，激光照射在微懸臂的背面，其反射光的位置也會(huì)因?yàn)槲冶鄣囊苿?dòng)而發(fā)生改變，這就產(chǎn)生了一定的偏移量，光電探測(cè)器將此偏移量記錄下來(lái)并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。

信息控制處理部分的作用，電信號(hào)通過控制器進(jìn)行信號(hào)處理，控制器驅(qū)動(dòng)電機(jī)進(jìn)行位置調(diào)節(jié)，處理后的結(jié)果反饋給系統(tǒng)，驅(qū)動(dòng)壓電陶瓷掃描器移動(dòng)，以保持樣品與探針針尖一定的作用力，通過一定的成像算法即可得到樣品表面形貌以及力學(xué)特性。

原子力顯微鏡在工作時(shí)，微懸臂的一端固定，另一端安裝一個(gè)探針，探針針尖的曲率半徑非常?。ㄔ诩{米量級(jí)），當(dāng)探針針尖與樣品表面輕輕接觸時(shí)，針尖尖端的原子與樣品表面的原子間存在極微弱的力（機(jī)械接觸力、范德華力、毛吸力、化學(xué)鍵、靜電力等等），掃描時(shí)控制針尖與樣品之間的作用力保持恒定，則微懸臂就會(huì)在垂直于樣品表面的方向做上下起伏運(yùn)動(dòng)，利用光學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)微懸臂對(duì)應(yīng)于掃描各點(diǎn)的位置變化，則可獲得樣品表面的形貌和力學(xué)性能信息。由于是通過測(cè)量針尖尖端的原子與樣品表面原子間的作用來(lái)進(jìn)行測(cè)量的，所以原子力顯微鏡測(cè)定樣品形貌的空間分辨率達(dá)到納米（nm）級(jí)，而力學(xué)性能的測(cè)量精度可達(dá)到皮牛頓（pN）量級(jí)。

常用的原子力顯微鏡工作模式主要包括接觸模式、非接觸模式和輕敲模式等。接觸模式工作時(shí)，探針的針尖始終與樣品保持接觸，針尖與樣品間的作用力為庫(kù)侖排斥力，其大小一般為10-8～10-11N。這種模式可以獲得穩(wěn)定的高分辨率圖像，但針尖在樣品表面上的移動(dòng)以及針尖與樣品間的黏附力，會(huì)對(duì)針尖造成損壞，也會(huì)使樣品產(chǎn)生形變，進(jìn)而產(chǎn)生虛像。非接觸模式工作時(shí)，控制探針針尖與樣品表面的距離保持在約5-20nm進(jìn)行掃描，檢測(cè)到的是探針針尖與樣品表面的吸引力和靜電力等，這種模式針尖不易被損壞，樣品表面不易被破壞，但是由于針尖與樣品之間的距離比較大，分辨率沒有接觸模式的高，實(shí)際上，由于針尖會(huì)被樣品表面的黏附力所捕獲，所以使得非接觸模式的操作變得非常困難。在輕敲模式工作中，針尖與樣品短時(shí)間接觸，針尖和樣品表面免遭破壞，輕敲模式探針針尖在接觸樣品表面時(shí)有較大的振幅（大于20nm），足以克服針尖與樣品之間的黏附力，其作用力介于接觸模式和非接觸模式之間，分辨率和接觸模式基本相近。目前，細(xì)胞研究中的操作模式大都采用輕敲模式。

不同接觸模式的力—距離曲線如圖2所示。接觸模式中針尖與樣品距離短，工作在斥力區(qū)，非接觸模式工作中針尖與樣品距離較大，工作在吸引力區(qū)。輕敲模式中探針樣品間隙接觸，并以一定振幅振動(dòng)，探針針尖與樣品的距離在一定范圍內(nèi)變化，針尖和樣品的作用力是引力和斥力的交互作用。

圖2 不同接觸模式的力—距離曲線

3.AFM應(yīng)用及系統(tǒng)研究進(jìn)展

由于AFM能夠在常壓下甚至在液體環(huán)境下直接觀測(cè)非導(dǎo)體樣品，不需要對(duì)樣品進(jìn)行任何特殊處理可獲得樣品真實(shí)的三維表面形貌以及力學(xué)特性，適合在空氣和溶劑體系中直接觀測(cè)細(xì)胞甚至活體細(xì)胞的表面形貌和結(jié)構(gòu)特征，因此，AFM已成為一種細(xì)胞形貌和力學(xué)特性研究的有力工具。近年來(lái)，AFM已在腫瘤細(xì)胞的研究中發(fā)揮了重要作用。腫瘤細(xì)胞是一種變異的細(xì)胞，這種變異細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)以及力學(xué)性能均與正常細(xì)胞不同，利用AFM可以觀測(cè)研究腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)的變化，從而揭示腫瘤細(xì)胞與健康細(xì)胞的相互聯(lián)系和區(qū)別，為腫瘤的診斷提供有力支撐④-⑥。此外，藥物與腫瘤細(xì)胞的相互作用會(huì)使細(xì)胞的形貌和力學(xué)性能產(chǎn)生一定的變化，AFM用來(lái)觀察研究藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)形貌和力學(xué)性質(zhì)的影響，為腫瘤藥物的篩選和腫瘤的治療提供了新的途徑⑦-⑨。隨著AFM技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，未來(lái)將在疾病診斷和治療以及新藥研發(fā)等方面發(fā)揮越來(lái)越大的作用⑩。

原子力顯微鏡自問世以來(lái)，經(jīng)過30余年的發(fā)展，從硬件到軟件都得到了迅速發(fā)展，各生產(chǎn)廠商開相繼開發(fā)出適于科學(xué)研究、工業(yè)和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的各種不同型號(hào)的產(chǎn)品，以滿足其在不同領(lǐng)域和場(chǎng)合應(yīng)用的需求。然而，AFM目前依然還存在成像范圍太小、掃描速度慢、檢測(cè)結(jié)果受探針影響較大等方面的缺點(diǎn)。近年來(lái)，研究人員不斷對(duì)AFM進(jìn)行改進(jìn)，如，為提高原子力顯微鏡的成像速度，劉璐⑾等提出了一種新的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)方案，Y、Z掃描器集成于測(cè)頭內(nèi)驅(qū)動(dòng)探針進(jìn)行慢軸掃描和形貌反饋，X掃描器與測(cè)頭分離，驅(qū)動(dòng)樣品做快軸掃描。X掃描器采用高剛性的獨(dú)立一維納米位移臺(tái)，能夠承載尺寸和質(zhì)量較大的樣品高速往復(fù)運(yùn)動(dòng)而不易發(fā)生共振；同時(shí)Z掃描器的載荷實(shí)現(xiàn)最小化，固有頻率得以顯著提高。為了避免測(cè)頭的掃描運(yùn)動(dòng)引起檢測(cè)光束與探針相對(duì)位置的偏差，設(shè)計(jì)了一種隨動(dòng)式光杠桿光路；為了便于裝卸探針以及精確調(diào)整激光在探針上的反射位置，設(shè)計(jì)了基于磁力的探針固定裝置和相應(yīng)的光路調(diào)節(jié)方案。對(duì)所搭建的AFM系統(tǒng)的初步測(cè)試結(jié)果表明，該系統(tǒng)在采用三角波驅(qū)動(dòng)和簡(jiǎn)單PID控制算法的情況下，可搭載尺寸達(dá)數(shù)厘米且質(zhì)量超過10g的較大樣品實(shí)現(xiàn)13μm×13μ m范圍50Hz行頻的高速成像。曾俊智等⑿研究了分布式原子力顯微系統(tǒng)，以解決由于低速成像和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的差異所帶來(lái)的誤差。把兩個(gè)原子力顯微鏡集成到一個(gè)操作系統(tǒng)中，可以在一個(gè)操作界面上對(duì)兩個(gè)原子力顯微鏡同時(shí)操作，實(shí)現(xiàn)對(duì)同一時(shí)刻不同細(xì)胞在相同生長(zhǎng)環(huán)境，相同細(xì)胞在同一時(shí)刻不同生長(zhǎng)環(huán)境、不同細(xì)胞在同一時(shí)刻同一生長(zhǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)狀態(tài)的分析，獲取樣品的效率顯著提高。黃強(qiáng)先等⒀研制了多模態(tài)動(dòng)態(tài)AFM，可以在三種反饋模式、不同階諧振狀態(tài)下對(duì)物體進(jìn)行掃描測(cè)量。利用該系統(tǒng)在不同反饋模式、不同階諧振狀態(tài)下進(jìn)行了掃描測(cè)試，結(jié)果顯示，系統(tǒng)在各模式下具有亞納米分辨力，其中在相位反饋模式，懸臂二階諧振時(shí)，達(dá)到最優(yōu)靈敏度與分辨力分別為17.5V/μm和0.29nm，該系統(tǒng)還存在頻率反饋不穩(wěn)定的問題，懸臂的高階諧振特性尚需深入研究，控制算法有待于進(jìn)一步完善。此外，針對(duì)AFM通常只能獲得樣品表面形貌和特征信息，難以獲得細(xì)胞內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)信息等缺點(diǎn)，研究人員將AFM與其他技術(shù)聯(lián)合使用實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，對(duì)AFM功能進(jìn)行擴(kuò)展，例如，AFM與光學(xué)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡的組合技術(shù)，已在細(xì)胞研究中獲得應(yīng)用⒁-⒃。例如，AFM與激光共聚焦顯微鏡的組合，用于細(xì)胞表面分子的高分辨率成像，激光共聚焦顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行選擇性的熒光標(biāo)記，而AFM則提供樣品的三維信息，AFM與超分辨光學(xué)顯微鏡組合，可以在獲取細(xì)胞形貌以及力學(xué)性質(zhì)的同時(shí)，還可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)部成分及結(jié)構(gòu)進(jìn)行定位和三維成像，大大提升了AFM在細(xì)胞物理化學(xué)特性研究中獲取信息的能力。

4.總結(jié)與展望

本文對(duì)AFM的基本結(jié)構(gòu)、原理和工作模式進(jìn)行了較為詳細(xì)的介紹，AFM通過檢測(cè)探針與樣品間的微弱相互作用力實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品表面形貌的成像和力學(xué)性能測(cè)試，其空間分辨率達(dá)納米（nm）級(jí)，力學(xué)靈敏度達(dá)皮牛(pN)級(jí)，AFM已成為探測(cè)生物樣品形貌和力學(xué)特性的有力工具，目前針對(duì)AFM系統(tǒng)掃描速度慢以及成像范圍小等缺點(diǎn)進(jìn)行了大量的改進(jìn)工作，并與其他技術(shù)聯(lián)用，取得較大進(jìn)展。相信隨著科學(xué)與技術(shù)的進(jìn)步，AFM將在生命科學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域獲得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

引文

①G.Bining,C.F.Quate,C.Gerber,Phys.Rev.Lett,1986,56:930-933.

②劉斌,李密,劉柱,等.電子顯微學(xué)報(bào),2017,369(6):610-623.

③王曉春,等.材料現(xiàn)代分析與測(cè)試技術(shù)[M].北京:國(guó)防工業(yè)出版社,2009.

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⒁葛林.力學(xué)進(jìn)展,2018,48:461-540.

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