韓永軍 牛福勇

陜西省榆林市第一醫(yī)院胃腸外科1(719000) 普外科2

背景：Slingshot-1(SSH1)通過使肌動蛋白解聚因子絲切蛋白再激活在細胞遷移的調控中發(fā)揮重要作用，被認為與腫瘤進展有關。目的：探討胃癌患者SSH1表達與預后的相關性。方法：納入2012年1月—2015年12月在榆林市第一醫(yī)院行胃癌根治手術的患者111例，部分患者術前于內鏡下取病變黏膜活檢標本，以real-time PCR和免疫組化法檢測SSH1 mRNA和蛋白表達，并與非癌胃黏膜進行比較。以免疫組化法檢測111例手術標本SSH1蛋白表達，分析其表達與胃癌臨床病理特征和患者預后的相關性。同時對預后影響因素行單因素和多因素分析。結果：胃癌組織中的SSH1 mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05)，且可見SSH1蛋白表達。111例胃癌患者中71例(64.0%)癌組織中SSH1表達陽性，SSH1表達與淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)，與其他腫瘤臨床病理參數(shù)無明顯相關性(P>0.05)。SSH1表達陽性患者中位總生存期顯著短于SSH1表達陰性患者(25.60個月對35.40個月，P=0.010，HR=1.71，95% CI: 1.14～2.57)。Cox回歸分析顯示淋巴結轉移和TNM分期為預后危險因素。結論：SSH1在胃癌組織中表達增高，并與預后不良有關，有望成為預測胃癌患者預后的生物學標記物。

Background:Slingshot-1 (SSH1) is involved in the regulation of cell migration by reactivating actin-depolymerizing factor/cofilin, and is considered to be associated with tumor progression.Aims:To explore the correlation between SSH1 expression and prognosis of patients with gastric cancer.Methods:A total of 111 gastric cancer patients receiving radical operation from Jan. 2012 to Dec. 2015 at the First Hospital of Yulin were enrolled. In some of the patients, endoscopic mucosal specimens were obtained preoperatively for detection of SSH1 mRNA and protein expressions by real-time PCR and immunohistochemistry, respectively. Gastric mucosal specimens obtained from non-gastric cancer patients were served as controls. Furthermore, surgical specimens were collected from all the 111 patients to determine the SSH1 protein expression by immunohistochemistry. The correlations of SSH1 expression with clinicopathological characteristics and prognosis were analyzed. Univariate and multivariate analyses were performed to identify the predictors of poor survival rate.Results:Expression of SSH1 mRNA in gastric cancer tissue was significantly higher than that in normal gastric mucosa (P<0.05). Protein expression of SSH1 could also be detected in gastric cancer tissue. In 111 gastric cancer patients, 71 (64.0%) were positive for SSH1 protein expression. SSH1 expression was correlated with lymph node metastasis (P<0.05), whereas no correlations were found between SSH1 expression and other clinicopathological parameters (P>0.05). The median overall survival of SSH1-positive patients was poorer than that of SSH1-negative patients (25.60 months vs. 35.40 months, P=0.010, HR=1.71, 95% CI: 1.14-2.57). Cox regression model revealed that lymph node metastasis and TNM staging were the predictors for poor prognosis in gastric cancer patients. Conclusions:SSH1 is up-regulated in gastric cancer tissue and is associated with a poor prognosis. It might be used as a biomarker for predicting the prognosis of gastric cancer patients.

胃癌為常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈不斷上升趨勢，在我國惡性腫瘤死因中居第二位[1-2]。胃癌傳統(tǒng)的治療方法包括手術、放療、化療等，然而治療效果個體差異較大[3]。近年興起的個體化醫(yī)療理念主張根據(jù)患者具體情況制訂特異性的治療方案，因此采用恰當手段在治療早期準確預測患者預后具有重要意義。

Slingshot-1(SSH1) cDNA全長4 467 bp，廣泛表達于心、腦、腎、甲狀腺、小腸等不同組織器官，編碼絲切蛋白(cofilin)特異性磷酸酶SSH。LIM激酶(LIMK)可使絲切蛋白末端第三位色氨酸磷酸化而失活，SSH則可通過去磷酸化使之再激活，激活的絲切蛋白通過抑制肌動蛋白絲聚合以及促進肌動蛋白絲解聚，參與細胞微絲骨架重排，因此SSH1通過絲切蛋白在細胞遷移的調控中發(fā)揮重要作用[4-6]，進而可能參與腫瘤細胞的侵襲和遷移。既往研究表明，LIMK/cofilin信號通路和SSH與人結直腸癌進展和化療耐藥有關[7]；在原發(fā)性乳腺癌中，SSH1L被認為在腫瘤轉移中起關鍵作用[8]；90%的終末期胰腺癌組織存在SSH1L高表達，SSH1L/絲切因子信號通路與胰腺癌細胞的侵襲、遷移有關[9]。然而，目前尚未見關于SSH1在胃癌中表達及其意義的研究報道。本研究旨在探討SSH1表達與胃癌臨床病理特征和患者預后的相關性，為臨床上采取更精準的治療方案提供依據(jù)，從而優(yōu)化臨床決策。

材料與方法

一、病例資料

2012年1月—2015年12月在榆林市第一醫(yī)院行胃癌根治手術的患者111例納入研究。入組患者均為初次診斷，術前未接受放療、化療、靶向治療等腫瘤相關治療，術后采取卡培他濱+奧沙利鉑方案化療。20例胃癌患者術前行胃鏡檢查，取病變黏膜活檢標本，保存于液氮中，用于后續(xù)實驗；同期20例排除胃癌以及其他消化系統(tǒng)疾病、其他器官系統(tǒng)惡性腫瘤、肝腎功能異常、凝血功能異常等情況的住院患者的內鏡胃黏膜活檢標本作為對照。采集患者性別、年齡以及腫瘤部位、大小、病理類型、淋巴結轉移情況、TNM分期等臨床病理資料，并收集手術癌組織標本用于后續(xù)實驗。

二、主要試劑

TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific)；Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(碧云天生物技術)；Real Master Mix(SYBR Green)(Takara Bio Inc.)；SSH1抗體(Abcam plc.)；免疫組化檢測SP試劑盒(廣州市凱秀貿易有限公司)。

三、方法

1. Real-time PCR：胃黏膜組織標本在冷凍條件下迅速研磨為勻漿，以TRIzol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，以之為模板行PCR擴增。按Real Master Mix(SYBR Green)說明書配置反應體系，反應于ABI 7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)中進行。引物序列：SSH1，F(xiàn) 5’-CAC AAG CAT GCA GGT GAT CT-3’，R 5’-TAT GTG CAT CCT TCC TGC TG-3’；GAPDH(內參)，F(xiàn) 5’-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3’，R 5’-GGG TCA TTG ATG GCA ACA ATA-3’。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。2-ΔΔCt法計算SSH1 mRNA相對表達量。

2. 免疫組化染色：組織塊梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。SP法免疫組化染色步驟參照試劑盒說明書進行，SSH1抗體按1∶1 000比例稀釋。DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、中性樹膠封片，風干后光學顯微鏡下觀察并拍照。

結果判定：由兩名病理醫(yī)師以盲法讀片，結果不一致時由第三名高年資醫(yī)師判定。SSH1陽性染色定位于細胞質。每張切片隨機觀察5個高倍視野，計數(shù)陽性細胞。陽性染色強度評分：0分，無著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性細胞比例評分：0分，0%～5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%。免疫組化評分為兩項評分之和，0～3分判定為SSH1表達陰性，4～7分判定為SSH1表達陽性。

3. 術后隨訪：隨訪截止至術后5年，評價指標為總生存期(overall survival, OS)，即術后至隨訪終點內(因任何原因)死亡的時間。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、SSH1在胃癌組織中的表達

Real-time PCR結果顯示，胃癌組織中SSH1 mRNA相對表達量明顯高于對照組非癌胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。免疫組化檢測亦顯示胃癌組織中SSH1蛋白呈陽性表達，而對照組SSH1基本為陰性表達(圖2)。

圖1胃癌患者(n=20)與對照組(n=20)胃黏膜組織SSH1mRNA表達比較

A：胃癌組織；B：對照組胃黏膜組織

圖2胃癌患者與對照組胃黏膜組織SSH1蛋白表達比較(免疫組化SP法，×200)

二、SSH1表達與胃癌臨床病理特征的關系

免疫組化檢測顯示，111例胃癌患者中71例癌組織中SSH1表達陽性，陽性率為64.0%，40例SSH1表達陰性。SSH1表達陽性胃癌患者淋巴結轉移率明顯高于SSH1表達陰性者(P<0.05)，SSH1表達與患者性別、年齡以及腫瘤部位、大小、病理類型、TNM分期無明顯相關性(P>0.05)(表1)。

三、不同SSH1表達情況胃癌患者生存分析

Kaplan-Meier曲線生存分析顯示，SSH1表達陽性 胃癌患者中位OS為25.60個月(95% CI: 19.75～31.45)，SSH1表達陰性患者中位OS為35.40 個月(95% CI: 26.77～44.03)，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.010, HR=1.71, 95% CI: 1.14～2.57)(圖3)。

四、預后因素的單因素和多因素分析

應用Cox回歸模型分析OS的影響因素，單因素分析顯示病理類型、淋巴結轉移和TNM分期為預后危險因素；將上述有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的變量進一步納入多因素分析，結果顯示淋巴結轉移和TNM分期為預后危險因素，兩者HR分別為2.62(95% CI: 1.75～3.54)和2.78(95% CI: 1.23～3.41)(表2)。

表1 SSH1表達與胃癌臨床病理特征關系分析

圖3 不同SSH1表達情況胃癌患者生存分析

變量單因素分析HR95% CIP值多因素分析HR95% CIP值性別 1.120.96～1.330.378年齡1.030.76～1.130.219腫瘤部位1.040.91～1.350.084腫瘤大小1.820.81～3.120.055病理類型2.001.68～2.230.0001.250.98～1.420.053淋巴結轉移1.231.05～1.310.0002.621.75～3.540.019TNM分期2.311.37～5.070.0002.781.23～3.410.030

討 論

惡性腫瘤的進展和轉移被認為是多種因素共同作用的結果，蛋白質的磷酸化與去磷酸化在細胞信號通路的調節(jié)中發(fā)揮重要作用，這一過程的失衡與腫瘤進展密切相關[10]。在哺乳動物中，由SSH1基因編碼的SSH磷酸酶能通過對肌動蛋白解聚因子絲切蛋白去磷酸化而使之再激活，從而促進肌動蛋白絲解聚[4-6]，并由此參與腫瘤侵襲和轉移。因此推測SSH1可能通過調節(jié)關鍵蛋白的磷酸化與去磷酸化過程影響胃癌進展和患者預后。

本研究以real-time PCR檢測胃癌患者與對照組胃黏膜活檢組織標本，結果顯示胃癌組織SSH1 mRNA表達水平在整體上顯著高于非癌胃黏膜。對兩組標本的免疫組化檢測亦顯示胃癌組織中SSH1蛋白呈陽性表達。進一步檢測111例胃癌患者術后癌組織標本中的SSH1蛋白表達，結果顯示71例(64.0%)胃癌組織SSH1表達陽性。分析表明SSH1表達與淋巴結轉移顯著相關，與患者性別、年齡以及腫瘤部位、大小、病理類型、TNM分期均無明顯相關性。生存分析顯示SSH1表達陽性患者中位OS明顯短于SSH1表達陰性患者(25.60個月對35.40個月)，提示SSH1表達與胃癌患者預后不良相關(HR=1.71)。上述發(fā)現(xiàn)表明SSH1與胃癌淋巴結轉移和患者預后不良有關，然而其參與調節(jié)胃癌進展、轉移的具體機制還需進一步研究。此外，Cox回歸分析顯示，淋巴結轉移和TNM分期是胃癌患者預后不良的危險因素，提示SSH1對胃癌預后的影響可能與參與腫瘤淋巴結轉移有關。

本研究的局限性主要在于，患者出院后仍繼續(xù)接受治療，出院后治療手段難以均一化導致結局事件的影響因素難以完全掌控。此外，本研究隨訪分析指標僅OS一項，而未評估無進展生存期、疾病進展時間等指標。后續(xù)研究設計需彌補上述缺陷。

綜上所述，本研究通過分析胃癌患者癌組織中的SSH1表達情況，并對患者進行長期隨訪觀察其5年生存率，發(fā)現(xiàn)SSH1在胃癌患者癌組織中表達增高，并與預后不良有關，有望成為預測胃癌患者預后的生物學標記物。