周寶宸，楊美娜，龐靖祥，張玉風(fēng)，韓金祥△

(1. 濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250020；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250062)

1 引 言

中藥藥性理論是中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的核心之一，狹義的中藥藥性是指寒、熱、溫、涼四性，而中醫(yī)在遣方用藥時運用的中藥藥性，正是中藥寒、熱、溫、涼的四種偏性，即是“以偏糾偏”。在現(xiàn)代中藥藥性研究中的思路與方法雖然能在一定程度上區(qū)分中藥的四性，但是中醫(yī)側(cè)重于整體論，西醫(yī)則以還原論為主導(dǎo)，大多數(shù)利用現(xiàn)代科學(xué)探索中藥四性理論的研究都脫離了中醫(yī)基礎(chǔ)理論的整體觀念。

超微弱生物光子輻射(ultra-weak photon emission,UPE)，即機體的電磁輻射(量子)是生命運動的過程中最根本的物質(zhì)相互作用產(chǎn)生的現(xiàn)象，是生物分子一種微觀能級的改變，理解為生物分子高能態(tài)和低能態(tài)的相互躍遷[1]，是生物有機體的一個固有功能，是生命現(xiàn)象之本質(zhì)屬性[2]。生物光子起源于生命物質(zhì)中多模光子輻射與集體生物分子之間的一種相干非線性相互作用[3]。大量實驗結(jié)果表明，生物光子輻射可以反映生物系統(tǒng)內(nèi)部的微觀信息及外界環(huán)境的微弱變化，且具有很高的靈敏度[4]和整體性。本研究利用柵藻作為生物指示劑的方法發(fā)現(xiàn)K值[5-6]可以表征中藥的寒熱藥性，在此基礎(chǔ)上，利用生物光子的相干性，通過對小鼠進(jìn)行中藥灌胃并進(jìn)行自發(fā)發(fā)光檢測，研究中藥藥性，探索最優(yōu)實驗條件，為基于小鼠中藥灌胃方法研究中藥藥性奠定基礎(chǔ)。

2 實驗材料

KM小鼠：35～40 g成年KM小鼠，購自濟(jì)南朋悅實驗動物有限公司，使用實驗鼠維持飼料，廠家：江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

主要儀器設(shè)備：9235QA型光電倍增管(英國ET Enterprises公司)，PM20SP型光電倍增管高壓電源(Sens-Tech公司)，C9744光子計數(shù)器(日本濱松公司HAMAMATSU)，PCI-e6320計數(shù)器卡(美國National Instruments公司)，超凈工作臺，尚朋堂電陶爐，康舒砂鍋，ACCULAB電子天平，燒杯，250 mL量筒，50 mL離心管，灌胃針，1 mL注射器。

3 實驗方法

3.1 中藥煎煮液制備[7]

用電子天平秤取中藥20 g，取400 mL水，與秤取好的中藥共同置于砂鍋中，浸泡2 h后用電陶爐加熱，火力2000，煮沸后調(diào)整火力到800，煎煮15 min，六層紗布濾出藥液待用，再取400 mL水倒入鍋中重復(fù)上述煎煮步驟，合并兩次藥液，去滓、再煎至藥液剩余50 mL，終藥濃度為0.4 g/mL。

3.2 基于柵藻指示劑法中藥藥性K值測定

本研究選用熱性藥當(dāng)歸與寒性藥黃芩兩味藥進(jìn)行初步研究。在使用柵藻為生物指示劑[5-6]的中藥藥性研究方法中，對兩味藥進(jìn)行K值測定，重復(fù)3次，通過顧參數(shù)[8]擬合所得方程(見表1)及K值(見圖1)。

表1中，測得當(dāng)歸的三次重復(fù)測定K值分別為9.083、10.624、9.5479，黃芩三次重復(fù)測定K值分別為1.8653、1.8918、2.9718，且兩味藥三次重復(fù)測定的結(jié)果較穩(wěn)定。圖1中當(dāng)歸與黃芩兩味藥三次重復(fù)測量的藥性K值存在統(tǒng)計學(xué)差異，K值可將熱性藥當(dāng)歸與寒性藥黃芩明顯的區(qū)分出來。

表1基于柵藻生物指示劑法的當(dāng)歸與黃芩顧參數(shù)擬合方程

Table1TheAngelicaandScutellariaGu-parameterfittingequationbasedonbiologicalindicatorofscenedesmus

藥品 當(dāng)歸 黃芩K1 y=9.083x+725.39R2=0.9891 y=1.8653x+472.72R2=0.9292 K2 y=10.624x+659.9R2=0.9888 y=1.8918x+1200.9R2=0.9802K3 y=9.5479x+702.15R2=0.9841 y=2.9718x+1170.4R2=0.9836

圖1當(dāng)歸與黃芩三次重復(fù)測量K值

Fig1TheKvaluewasmeasuredrepeatedlyinthe

AngelicaandScutellaria

3.3 中藥灌胃小鼠16 d連續(xù)檢測

3.3.1實驗條件 35～40 g成年小鼠，分籠喂養(yǎng)，每籠8只，適應(yīng)環(huán)境5 d后進(jìn)行灌胃及測量，剃腹部與背部被毛，中藥煎煮液藥物濃度0.4 g/mL，灌胃劑量0.1 mL/10 g(小鼠體重)，qd，每只小鼠測量前30 min灌胃。麻醉濃度及劑量為2%戊巴比妥鈉，0.025 mL/10 g(小鼠體重)，每只小鼠測量前5 min進(jìn)行麻醉。

參數(shù)設(shè)置：PM20SP型光電倍增管高壓電源設(shè)置數(shù)值：左726 V、右846 V；(1)Measurement time(s):1 s；Measurement points:300 ；(2)Measurement time(s):0.05 s；Measurement points:6000，腹部與背部測量時參數(shù)設(shè)置相同。

測量時要求室溫恒定為20℃，遮蓋黑色洞巾，暗室操作，減少光照及延遲發(fā)光對實驗結(jié)果的影響。設(shè)置當(dāng)歸組、黃芩組、空白組三組，連續(xù)測量16 d，統(tǒng)計分析后比較三組測量值。

3.3.2數(shù)據(jù)處理分析 對測量間隔時間0.05 s，測量點6000的數(shù)值進(jìn)行處理,去除測量過程中由于儀器及環(huán)境因素所產(chǎn)生的異常值后，計算其平均值M，生物自發(fā)發(fā)光平均強度C=M×20-bg，即平均值乘20得出每秒的UPE平均強度，再減去20次檢測背景噪聲的平均值，即是本次測量的自發(fā)發(fā)光平均強度。將通過計算獲得的腹部UPE平均強度除以背部UPE平均強度，得到腹背自發(fā)發(fā)光平均強度比值，然后使用SPSS 19.0對各組之間腹背每秒UPE強度進(jìn)行t-檢驗。

4 結(jié)果與討論

4.1 腹部與背部自發(fā)發(fā)光平均強度

根據(jù)3.3.2中計算所得三組腹部與背部UPE強度(見圖2、圖3、圖4、圖5)的結(jié)果，我們對當(dāng)歸組與空白組、黃芩組與空白組的腹部UPE強度與背部UPE強度進(jìn)行比較，可以看出，當(dāng)歸組與空白組、黃芩組與空白組腹部與背部UPE強度隨檢測天數(shù)的增加均出現(xiàn)逐漸增高的趨勢，而這一趨勢與小鼠的體重的增加有關(guān)，但相同檢測天數(shù)的當(dāng)歸組與空白組、黃芩組與空白組UPE強度之間無統(tǒng)計學(xué)差異，這正說明了生物發(fā)光所表述的是生命體的整體狀態(tài)[9-10]，它攜帶著大量的生物學(xué)信息，包括體重、體溫、饑飽度、勞累度、情志、及其他小鼠自身或者儀器穩(wěn)定性等因素影響，而這些微量因素的共同作用造成了小鼠整體狀態(tài)的改變，在生物光子測量中反映在UPE強度的變化，所以灌胃的強條件刺激這單一變量所造成的影響則被其他影響因素的疊加所湮滅。

圖2當(dāng)歸組與空白組腹部自發(fā)發(fā)光強度隨灌胃天數(shù)變化

Fig2TheSPIoftheabdomenofAngelicagroupandblankgroupwaschangedwiththenumberofdays

圖3當(dāng)歸組與空白組背部自發(fā)發(fā)光強度隨灌胃天數(shù)變化

Fig3TheSPIofthebackofAngelicagroupandblankgroupchangedwiththenumberofdays

圖4黃芩組與空白組腹部自發(fā)發(fā)光強度隨灌胃天數(shù)變化

Fig4TheSPIoftheabdomenofScutellariagroupandblankgroupwaschangedwiththenumberofdays

圖5黃芩組與空白組腹部自發(fā)發(fā)光強度隨灌胃天數(shù)變化

Fig5TheSPIofthebackofScutellariagroupandblankgroupchangedwiththenumberofdays

4.2 中藥灌胃小鼠腹背自發(fā)發(fā)光強度比值與最佳檢測時間

為了凸顯灌胃單一影響因素的作用及結(jié)果，我們利用小鼠腹部UPE強度與背部UPE強度的比值的數(shù)據(jù)處理方法來消除灌胃以外的其他因素的影響，包括小鼠自身及儀器穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖6、圖7。

圖6為當(dāng)歸組與空白組連續(xù)檢測16 d腹部與背部UPE強度比值變化，可知當(dāng)歸組與空白組腹背UPE強度比值相比，當(dāng)歸組腹背UPE強度比值有升高的趨勢，并且在第1 d到第4 d間斷產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)差異，在第5 d到第11 d當(dāng)歸組與空白組腹背UPE強度比值之間的統(tǒng)計學(xué)差異持續(xù)存在，在第12 d至第16 d內(nèi)，兩組比值之間未測及差異產(chǎn)生。這說明當(dāng)歸組小鼠在第5 d至第11 d內(nèi)通過當(dāng)歸中藥煎煮液灌胃的腹背UPE強度的比值與空白組存在統(tǒng)計學(xué)差異，同樣說明第5 d至第11 d是使用當(dāng)歸中藥煎煮液灌胃小鼠產(chǎn)生效果最穩(wěn)定的時間和在3.3.1中的實驗條件下進(jìn)行自發(fā)發(fā)光檢測最佳的時間。

圖7是黃芩組與空白組連續(xù)檢測16 d腹部與背部UPE強度的比值變化，從圖中我們可以看出黃芩組與空白組腹背UPE強度比值相比較，黃芩組腹背UPE強度比值有降低的趨勢，兩組UPE強度的比值之間在第2 d到第10 d內(nèi)所產(chǎn)生的統(tǒng)計學(xué)差異持續(xù)存在，在第11 d至第16 d內(nèi)，兩組比值之間的統(tǒng)計學(xué)差異只在第12 d與第15 d時出現(xiàn)，其余時間均未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。這說明黃芩組小鼠在第2 d至第10 d內(nèi)通過黃芩中藥煎煮液灌胃的腹背UPE強度的比值與空白組存在統(tǒng)計學(xué)差異，這也表明這段時間是使用黃芩中藥煎煮液灌胃小鼠產(chǎn)生效果最穩(wěn)定的時間和在3.3.1中的實驗條件下進(jìn)行自發(fā)發(fā)光檢測最佳的時間。

由于不同中藥所具有的藥性的差別，灌胃后中藥煎煮液作用于小鼠的效果強弱不同，在3.3.1的實驗條件下我們所進(jìn)行的灌胃小鼠超微弱發(fā)光的檢測中，雖然在灌胃的第1 d均開始表現(xiàn)出變化，并且熱性藥(當(dāng)歸)的比值相較空白組的比值升高，寒性藥(黃芩)的比值相較空白組的比值降低，但其產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)差異的灌胃時間不盡相同。綜上，無論熱性藥或者寒性藥，在上述實驗條件下使用中藥煎煮液對小鼠灌胃的第5 d到第10 d之間，可以作為基于小鼠超微弱發(fā)光的中藥藥性研究實驗檢測的最佳時間。

圖6當(dāng)歸組與空白組連續(xù)檢16d腹部與背部自發(fā)發(fā)光強度比值,A-P

Fig6TheratioofSPIoftheabdomenandbackfor16daysintheAngelicagroupandtheblankgroup,A-P

圖7黃芩組與空白組連續(xù)檢測16天腹部與背部自發(fā)發(fā)光強度比值,A-P

Fig7TheratioofSPIoftheabdomenandbackfor16daysintheScutellariagroupandtheblankgroup,A-P

5 結(jié)論

本研究主要探討基于小鼠超微弱發(fā)光的中藥藥性研究的實驗中對于不同寒熱藥性中藥灌胃小鼠在其腹背自發(fā)發(fā)光比值中所表現(xiàn)出的趨勢及差異和產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)差異的最佳檢測時間，并通過不同藥組與空白組腹背自發(fā)發(fā)光比值所產(chǎn)生的差異來表征不同的中藥藥性。首先通過基于柵藻生物指示劑法重復(fù)測定當(dāng)歸與黃芩的K值，驗證了使用柵藻指示劑法的K值來表征中藥藥性這一種方法的穩(wěn)定性；然后通過對當(dāng)歸藥組灌胃小鼠與空白組小鼠、黃芩藥組灌胃小鼠與空白組小鼠腹部與背部UPE強度比值的分析，發(fā)現(xiàn)無論熱性、寒性藥組在灌胃的第一天即開始發(fā)生變化，當(dāng)歸組的腹背UPE強度比值相較空白組升高,黃芩組腹背UPE強度比值相較空白組降低；當(dāng)歸組與空白組、黃芩組與空白組出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異并且這種統(tǒng)計學(xué)差異均穩(wěn)定存在的時間為第5 d和第10 d之間，同時這也是基于小鼠超微弱發(fā)光的中藥藥性研究的實驗中對小鼠使用中藥煎煮液灌胃后的生物發(fā)光行為最佳檢測時間。

韓金祥等[11-12]基于生物光子相干理論[13]提出中藥藥性量子假說，提出機體電磁輻射(量子)可以表征中醫(yī)之氣[14-15]，四氣是調(diào)節(jié)機體電磁輻射量子疊加態(tài)的度量，通過檢測不同藥性中藥生物光子輻射行為的差異，可從整體上獲得表征中藥藥性的生物光子量化指標(biāo)。在此理論的指導(dǎo)下，本研究在探索并優(yōu)化的基于小鼠超微弱發(fā)光的中藥藥性研究的實驗條件的基礎(chǔ)上，連續(xù)檢測16 d當(dāng)歸與黃芩中藥煎煮液灌胃后小鼠的生物發(fā)光行為，發(fā)現(xiàn)其不同中藥灌胃組與空白組的腹背UPE強度比值均在第5 d至第10 d存在穩(wěn)定的統(tǒng)計學(xué)差異，并認(rèn)為此段時間為中藥煎煮液灌胃后小鼠生物發(fā)光行為的最佳檢測時間。當(dāng)然，這只是基于實驗結(jié)果的初步結(jié)論，還需要大量的實驗進(jìn)行驗證，但是這為基于小鼠超微弱發(fā)光的中藥藥性研究的動物實驗平臺的搭建奠定了基礎(chǔ)，為利用生物發(fā)光的方法研究中藥藥性開辟了新道路，為中藥藥性的研究提供了新的思路。