牛 歡，謝卓宓，古 力，梁 瑩，韋坤華，繆劍華，李明杰,3，張重義,3*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 作物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.廣西壯族自治區(qū) 藥用植物園，廣西 南寧 530023；3.福建農(nóng)林大學(xué) 作物遺傳育種與綜合利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)又名金線蘭、金蠶、烏人參、金線入骨消等，是一種多年生蘭科草本植物[1]。主產(chǎn)于中國、印度等幾個(gè)亞洲國家，國內(nèi)金線蓮主要在福建、云南等地種植。金線蓮含多糖、黃酮類化合物、生物堿等多種成分，具有抗衰老、提高機(jī)體免疫等功效[2]。但由于金線蓮對(duì)生長環(huán)境要求嚴(yán)格，種子缺乏胚乳、自然條件下發(fā)芽率極低，導(dǎo)致種質(zhì)資源匱乏。目前，生產(chǎn)上金線蓮多采用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行繁育[3]。雖然金線蓮的組培技術(shù)也相對(duì)較為成熟，但從組培苗移栽到大田環(huán)境下，組培苗的質(zhì)量和煉苗環(huán)節(jié)仍然是影響最終成活率的關(guān)鍵因素。這使得具有優(yōu)良基礎(chǔ)的金線蓮組培苗成了決定其成活率以及煉苗有效性的前提條件。為了獲取金線蓮林下移栽所需要的最佳長勢(shì)組培苗，本研究立足前期金線蓮繁育和栽培體系基礎(chǔ)，外源添加蘭科通用肥料花多多1號(hào)、11號(hào)，研究不同外源添加物水平對(duì)金線蓮組培苗生長狀況、多糖含量、可溶性蛋白含量與移栽成活率的影響。本研究不僅為金線蓮進(jìn)行煉苗和后期移栽提供優(yōu)良的材料，也為提高金線蓮的安全生產(chǎn)和有效性奠定重要組培技術(shù)支撐。

1 材料與處理

1.1 試驗(yàn)材料

以福建省廣泛種植的金線蓮品種“泰寧一號(hào)”為試驗(yàn)材料，在福建農(nóng)林大學(xué)中藥材GAP研究所內(nèi)，將MS、B5培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，詳細(xì)研究不同外源添加肥料對(duì)金線蓮組培苗的影響，以獲取能夠在林下或大棚成活率高且有效的組培苗。

1.2 試驗(yàn)處理

基于課題組前期已經(jīng)構(gòu)建的金線蓮繁殖體系[4]的研究基礎(chǔ)，以MS/B5+瓊脂7 g/L+蔗糖25 g/L+NAA 0.2 mg/L+活性炭1.5 g/L作為基礎(chǔ)培養(yǎng)體系。分別添加0、1、2、3 g等不同水平的蘭科專用肥(花多多11號(hào))和普用肥(花多多1號(hào))。選擇長勢(shì)一致的金線蓮增殖苗，以莖段接種方式接種到相應(yīng)培養(yǎng)基上[5]，每瓶接種15叢，每個(gè)處理接種10瓶，每個(gè)處理3組重復(fù)。培養(yǎng)條件設(shè)置為溫度25 ℃左右，光照強(qiáng)度750～1500 lx，光照時(shí)長10～12 h/d[6]。接種150 d后移出培養(yǎng)基，對(duì)其生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，并在每個(gè)處理中選取長勢(shì)相對(duì)一致的種苗進(jìn)行林下移栽，移栽30 d后統(tǒng)計(jì)各處理成活率，最終獲取林下移栽所需的最佳處理。

2 試驗(yàn)方法

2.1 生物量測(cè)定

在接種后150 d進(jìn)行取樣，統(tǒng)計(jì)金線蓮植株莖高與莖粗、葉片長寬、根長與根粗、鮮重與干重，并計(jì)算其折干率。

2.2 多糖含量測(cè)定

接種后150 d對(duì)移出的組培苗進(jìn)行多糖含量的測(cè)定，并根據(jù)蒽酮-硫酸比色法測(cè)定多糖含量[7]。取金線蓮全株，在40 ℃的真空干燥箱內(nèi)烘干1 h，將植株取出后研磨成細(xì)粉狀，經(jīng)380 μm孔徑篩進(jìn)行過濾；60 ℃水浴，超聲振蕩提取40 min；在4200 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min后取上清液。將所獲取的沉淀加水，重復(fù)離心2次，合并3次上清液，將其低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL。移取3 mL提取液加入蒽酮試劑反應(yīng)，進(jìn)行沸水浴加熱后迅速移入冷水浴冷卻，在625 nm下測(cè)定A(吸收度)值。根據(jù)試驗(yàn)中建立的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.0495x-0.0059(R2=0.9911)計(jì)算多糖含量。

2.3 可溶性蛋白測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[8]測(cè)定總蛋白含量，稱取各處理鮮樣0.5 g，將研缽置于冰浴中研磨，添加4次0.05 mol/L pH=7.8磷酸緩沖液，第一次添加1.5 mL，其余3次添加1 mL，研磨成漿后移入離心管，于4 ℃、14000 r/min條件下離心15 min，取上清液為待測(cè)蛋白。采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測(cè)定，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。使用分光光度計(jì)在595 nm下比色測(cè)定可溶性蛋白含量。按照以下公式計(jì)算出可溶性蛋白含量[9]。

其中，C為按照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的蛋白含量，V為提取蛋白的提取液體積，D為溶液稀釋倍數(shù)，M為研磨用的鮮樣品質(zhì)量，Vt為測(cè)定時(shí)取用的待測(cè)液的體積。

2.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel對(duì)不同處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用DPS軟件對(duì)不同處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[10]。

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)基內(nèi)外源添加肥料對(duì)金線蓮生長狀況的影響

以普通MS和B5培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同水平的花多多1號(hào)與花多多11號(hào)，研究其對(duì)金線蓮組培苗生長的影響。從2種培養(yǎng)基總體上來看，B5+添加物的培養(yǎng)基能夠顯著促進(jìn)金線蓮組培苗根數(shù)量增加。在2種培養(yǎng)基中分別加入不同水平的花多多均能夠促進(jìn)根數(shù)增加，但對(duì)根長的影響相對(duì)較小。同時(shí)，B5+花多多1號(hào)的效應(yīng)顯著優(yōu)于B5+花多多11號(hào)。值得注意的是，B5加2～3 g花多多11號(hào)的處理之間效果無顯著差異。因此，在生長過程中如果想獲取根系較多的組培苗，可以用B5培養(yǎng)基加入適量花多多1號(hào)誘發(fā)苗體產(chǎn)生更多根系。根據(jù)表1可以發(fā)現(xiàn)，B5+3 g花多多1號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)金線蓮根數(shù)量的增長情況更加明顯；但對(duì)于平均根長的影響，MS培養(yǎng)基優(yōu)于B5培養(yǎng)基，MS+2 g花多多1號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)平均根長增加更為明顯，并且其生根數(shù)與B5+3 g花多多1號(hào)處理相比，在0.01水平上無顯著差異性。綜合根長與根數(shù)來看，MS+2 g花多多1號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)金線蓮根系生長狀況最好，最適合移栽。

根據(jù)表2所示，金線蓮莖長與莖粗的增加以MS+2 g花多多1號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)效果更為顯著。MS+3 g花多多1號(hào)培養(yǎng)基與B5+2 g花多多11號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)金線蓮葉片寬度與其他處理有明顯差異，其葉片寬度明顯大于其他處理下的葉片寬度。對(duì)于葉片長度，B5+2 g花多多11號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)金線蓮葉片長度明顯大于其他處理。綜合葉寬與葉長，以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)時(shí)添加2 g花多多11號(hào)對(duì)金線蓮葉片生長最有利?？傮w而言，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加花多多1號(hào)的培養(yǎng)基中，金線蓮組培苗在莖長、莖粗等生長指標(biāo)明顯優(yōu)于其它處理；在以B5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的條件下添加花多多11號(hào)金線蓮的葉片生長狀況較好。

培養(yǎng)基中添加外源添加物對(duì)組培苗莖、葉的影響與對(duì)根系生長的影響相反。從2種培養(yǎng)基的本底來看，MS培養(yǎng)基更有利于根、莖的生長，B5培養(yǎng)基更有利于葉片的生長。從不同添加物來看，花多多1號(hào)更有利于莖葉的生長。此外，從培養(yǎng)基和外源添加物的組合來看，MS+花多多1號(hào)相比其它處理能夠顯著促進(jìn)根的生長和莖部的伸長和加粗。綜合不同處理對(duì)金線蓮組培苗根、莖、葉生長的影響可以看出，不同處理組合對(duì)根和莖、葉的生長影響存在著差異，這種差異更多是由于培養(yǎng)基本身性質(zhì)所決定。因此，在金線蓮的生產(chǎn)實(shí)踐中，應(yīng)該考慮不同培養(yǎng)基及添加物對(duì)苗體的影響，依據(jù)具體需求進(jìn)行合理搭配以獲取理想的移栽壯苗。

表1 添加肥料對(duì)于金線蓮根系生長狀況的影響

注：表中小寫字母表示不同處理在P<0.05水平上的差異顯著性，大寫字母表示不同處理在P<0.01水平上差異顯著性。下表同。

表2 添加肥料對(duì)于金線蓮莖葉生長狀況的影響

3.2 外源添加物對(duì)金線蓮組培苗的生物量及移栽成活率的影響

各處理中以MS+2 g花多多11號(hào)處理的金線蓮組培苗平均折干率最高，達(dá)到26.53%，與其他處理呈現(xiàn)出明顯差異，表明以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2 g花多多11號(hào)能明顯增加金線蓮組培植株的干物質(zhì)積累。在金線蓮生產(chǎn)上，大棚或林下環(huán)境中組培苗的移栽成活率對(duì)于金線蓮后期產(chǎn)量收獲具有重要意義。一般情況下影響金線蓮移栽成活率主要包括2個(gè)方面因素：一個(gè)是健壯金線蓮組培苗壯苗培育；另外一個(gè)是移栽馴化環(huán)節(jié)。本研究選擇闊葉林栽培不同處理培養(yǎng)基的組培苗，并對(duì)其移栽成活率進(jìn)行觀察和記錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在栽培30 d后，MS+2 g花多多1號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)的金線蓮組培苗成活率最高，達(dá)到83.12%，MS+0 g花多多成活率最低，只有70.77%。這表明適當(dāng)?shù)奶砑臃柿峡娠@著提高金線蓮組培苗移栽成活率。

表3 不同培養(yǎng)基植株生物量積累及移栽成活率

3.3 不同外源添加物對(duì)金線蓮多糖及可溶性蛋白含量的影響

為了進(jìn)一步了解不同外源添加物對(duì)組培苗的藥用活性成分影響。對(duì)不同培養(yǎng)基生長條件下金線蓮組培苗多糖及可溶性蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定。從測(cè)定結(jié)果可以看出，以B5+3 g花多多1號(hào)培養(yǎng)基上生長的金線蓮植株內(nèi)可溶性蛋白含量最高，達(dá)到8.19 mg/g；以MS+2 g花多多11號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)的金線蓮多糖含量最高，達(dá)到23.51 mg/g。綜合以上結(jié)果得出，在MS和B5培養(yǎng)基內(nèi)添加外源添加物能夠顯著提升金線蓮組培苗內(nèi)多糖和蛋白含量。多糖和游離蛋白含量水平在一定程度上能夠反映出苗體的代謝水平和長勢(shì)。因此，本研究的結(jié)果說明金線蓮組培培養(yǎng)基內(nèi)適當(dāng)增添外源添加物能顯著提高組培苗的代謝水平。

圖a為多糖含量、圖b為可溶性蛋白含量；CK1、CK2代表兩個(gè)空白，A、B、C、D分別表示MS花多多1號(hào)、MS花多多11號(hào)、B5花多多1號(hào)、B5花多多11號(hào)，1、2、3代表添加花多多的質(zhì)量1、2、3 g

圖1不同培養(yǎng)基添加物內(nèi)金線蓮藥用活性成分含量

4 討論

將組培苗移栽到設(shè)施栽培和林下栽培環(huán)境中，組培苗的成活率是影響后期產(chǎn)量和品質(zhì)的決定性因素之一。目前，在金線蓮組織培養(yǎng)的過程中，多采用在培養(yǎng)基中添加不同種類與用量的生長素[11]、碳源物質(zhì)[12]等方法，以研究其對(duì)組培苗生長強(qiáng)弱和相應(yīng)的壯苗效果的影響。前期的研究表明在金線蓮培養(yǎng)基中適當(dāng)添加香蕉等外源添加物能顯著改善組培苗的長勢(shì)和長相[13]。花多多是重要的蘭科植物肥料，其中，花多多1號(hào)的基本配方為氮∶磷∶鉀=1∶1∶1[15]，加上世界專利的M-77微量元素組合使作物吸收養(yǎng)分更均衡，可以作為所有植物的通用肥料；花多多11號(hào)高鉀含量(N∶K=1∶5.2 )極大地滿足如蘭花這類具肉質(zhì)根或假球莖植物對(duì)鉀肥的需求。研究發(fā)現(xiàn)花多多肥料能夠顯著促進(jìn)植物的生長和發(fā)育[14]，添加于不同的培養(yǎng)基中能夠顯著改善組培苗的生長狀況。目前，在金線蓮培養(yǎng)基中添加肥料對(duì)金線蓮組培苗影響的研究相對(duì)較少。本研究通過添加不同水平2種肥料，詳細(xì)研究了適量花多多肥料對(duì)金線蓮組培苗品質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：添加不同種類和不同量的肥料對(duì)金線蓮組培苗的長勢(shì)及營養(yǎng)成分均有不同程度的影響，并且發(fā)現(xiàn)金線蓮組培苗的長勢(shì)與營養(yǎng)成分含量無關(guān)，例如MS+2 g花多多1號(hào)處理下金線蓮組培苗長勢(shì)最好、移栽成活率最高,但其多糖成分僅有15.33 mg/g,可溶性蛋白含量為6.39 mg/g，均未達(dá)到最大含量；MS+2 g花多多11號(hào)處理下，雖然金線蓮生長狀況不佳，但其折干率與多糖含量最高。綜合來看，MS+2 g花多多1號(hào)處理下更利于培育壯苗、提高移栽成活率，同時(shí)，也可以看出花多多1號(hào)對(duì)于金線蓮的生長更有利。雖然本文具體研究了不同花多多添加水平對(duì)金線蓮組培苗的生長和長勢(shì)的影響，沒有系統(tǒng)結(jié)合金線蓮組培苗、后期設(shè)施和林下栽培技術(shù)體系進(jìn)行系統(tǒng)研究，因此，后續(xù)還需進(jìn)一步結(jié)合大田栽培進(jìn)行深入研究。

致謝：感謝作物生態(tài)與分子生理學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué))對(duì)本研究的支持。