姜愛(ài)蘭，王信海，丁辰龍，吳學(xué)軍，唐金玉，王飛飛，葉建勇

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223800)

寬體金線蛭(Whitmaniapigra)，隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)(Annelida)有環(huán)帶亞門(mén)(Clitella)蛭綱(Hirudinea)真蛭亞綱(Euhirudinea)無(wú)吻蛭目(Arhynchobdellida)醫(yī)蛭形亞目(Hirudiniformes)黃蛭科(Haemopidae)金線蛭屬(Whitmania)，別名螞蟥、肉鉆子、水癡馬鱉[1]，是傳統(tǒng)的名貴中藥材，現(xiàn)代研究證明其涎液中含有一種由65～66種氨基酸組成的酸性低分子多肽、抗血凝物質(zhì)，稱(chēng)為水蛭素、肝素、抗血栓素等[2]，可治療中風(fēng)、閉經(jīng)、截癱、心絞痛、無(wú)名腫疼、腫瘤、頸淋巴結(jié)核等疾病，能使移植手術(shù)后的靜脈血管保持暢通，其蜂蜜浸出液亦可治療角膜潰病和角膜云翳，具有廣泛的藥用價(jià)值[3]。近年來(lái)，以水蛭為原料的藥品及保健品日漸增多，但由于各種天然水體中大量生活和工業(yè)污水的排入，農(nóng)田中大量施用化肥和農(nóng)藥，加上人為地酷漁濫捕，其種群數(shù)量急劇減少，自然資源日漸萎縮，幾乎很難形成產(chǎn)量，種質(zhì)資源也受到嚴(yán)重破壞，從而導(dǎo)致其藥材及藥品價(jià)格不斷攀升，因此水蛭的人工養(yǎng)殖日趨受到重視[4]，也為漁民致富開(kāi)辟了新的途徑。

目前，寬體金線蛭的研究工作大多集中在繁、養(yǎng)殖技術(shù)上[5-14]，對(duì)其種質(zhì)資源狀況的研究還未見(jiàn)報(bào)道，為了解各個(gè)地理區(qū)域種群的遺傳背景和遺傳差異狀況以及遺傳差異與生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)性，本研究開(kāi)展了不同地區(qū)寬體金線蛭遺傳差異性分析及生長(zhǎng)指標(biāo)的比較研究，以期為今后寬體金線蛭種質(zhì)資源保護(hù)和遺傳育種及繁、養(yǎng)殖技術(shù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

寬體金線蛭親蛭和幼蛭于2016年3～5月分別從江蘇宿遷的駱馬湖(SQ)、江蘇興化的烏巾蕩(XH)、江蘇吳江的太湖(WJ)、湖北大悟縣的竹竿河(DWX)和黑龍江賓縣的松花江(BX)野外采集，活體運(yùn)回試驗(yàn)基地，置于掛在池塘內(nèi)的60目網(wǎng)箱(規(guī)格：2.0 m×4.0 m×1.2 m)內(nèi)暫養(yǎng)，暫養(yǎng)前1 d投放足量的活田螺，供親蛭、幼蛭暫養(yǎng)期間攝食。仔蛭來(lái)源于親蛭人工孵化后收集的幼蛭。

1.2 基因組DNA提取

采用CTAB法提取樣品基因組DNA。(1)在65 ℃水浴鍋中預(yù)熱 CTAB 提取液；(2)在液氮中迅速研磨樣品，將粉末狀材料轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入預(yù)熱的CTAB提取液(每克樣品加入3～5 mL提取液)，65 ℃保溫30～60 min，每隔 10 min輕輕顛倒混勻；(3)11000 r/min條件下離心5 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管；(4)加入等體積酚/氯仿(1∶1)，充分混勻，11000 r/min離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管；(5)加入等體積氯仿，充分混勻，11000 r/min離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管；(6)重復(fù)步驟4、步驟5；(7)加入2/3體積的異丙醇混勻，室溫放置，沉淀 15 min；(8)11000 r/min條件下離心6 min，棄上清；(9)將沉淀用70%的乙醇漂洗一次，室溫條件下11000 r/min離心2 min，棄上清，重復(fù)洗一次；(10)提取產(chǎn)物2～3 μL用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RAPD分析

1.3.1 RAPD 反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件 PCR擴(kuò)增體系(20 μL)為：DNA 模板 2 μL，primer 1 μL,藍(lán)色Mix 10 μL，去離子水7 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，36 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸1.5 min；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.2 RAPD 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 用30對(duì)引物對(duì)5個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息見(jiàn)表1，將PCR產(chǎn)物在2.0%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)。

1.4 生長(zhǎng)試驗(yàn)

分別測(cè)定仔蛭和幼蛭的生長(zhǎng)指標(biāo)。

仔蛭生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定：分別從不同地理種群同一天孵出的仔蛭暫養(yǎng)槽內(nèi)隨機(jī)取180條仔蛭分3組放于編好號(hào)的玻璃鋼水缸(尺寸：40 cm×50 cm×30 cm)中進(jìn)行成活率統(tǒng)計(jì)和生長(zhǎng)指標(biāo)比較試驗(yàn)，玻璃鋼水缸頂部用80目網(wǎng)片封住，水深10 cm左右，內(nèi)部放2～3段PVC管，供幼稚棲息，每天換水2/3，投喂冰凍輪蟲(chóng)和初孵豐年蟲(chóng)。每隔5 d投喂殼寬3～5 mm左右的活的小田螺，每5 d從每缸內(nèi)隨機(jī)取15條仔蛭稱(chēng)重，21 d后取出全部稱(chēng)重，計(jì)算平均體質(zhì)量。

表1 RAPD引物信息

幼蛭生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定：分別從不同地理種群的暫養(yǎng)網(wǎng)箱內(nèi)隨機(jī)取120條3～4 g幼蛭平均分3組放于同池塘編好號(hào)的60目水蛭養(yǎng)殖專(zhuān)用網(wǎng)箱(尺寸：100 cm×100 cm×110 cm)內(nèi)進(jìn)行成活率統(tǒng)計(jì)和生長(zhǎng)指標(biāo)比較試驗(yàn)。池塘水溫平均24.9±1.2 ℃，pH 7.6～8.4，溶解氧6.13～7.02 mg/L，水深85 cm左右，網(wǎng)箱內(nèi)部放栽種苦草的花盆2盆，直徑110 mm的PVC管2～3段，供幼蛭棲息。每隔5 d投喂殼寬9～12 mm左右的活的田螺，對(duì)每條幼蛭稱(chēng)重，計(jì)算平均體質(zhì)量。

生長(zhǎng)指標(biāo)的平均日增重、相對(duì)增重率和特定增重率分別按下列公式計(jì)算：

平均日增重：AGR/(g/d)=(W2-W1)/(t2-t1)

相對(duì)增重率：RGR/%=100×(W2-W1)/[W1×(t2-t1)]

特定增重率：SGR/%=100×(lnW2-lnW1)/(t2-t1)

式中：W2表示蛭第t2天平均體質(zhì)量(g)，W1表示蛭第t1天平均體質(zhì)量(g)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

RAPD分析的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳位置在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無(wú)DNA條帶記為0，如表2，形成RAPD的表型數(shù)據(jù)矩陣用NTSYS軟件計(jì)算相似系數(shù)(DICE系數(shù))，并且按照遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析。采用SPSS 13統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗(yàn)不同地域?qū)掦w金線蛭生長(zhǎng)指標(biāo)影響的顯著性，用最小極差法(LSD)中的Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，P<0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15-16]。

表2 01數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(部分)

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)5個(gè)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，30條引物擴(kuò)增如圖1、圖2。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果P1～P15(M:DL2000)

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果P16～P30(M:DL2000)

2.2 供試材料的親緣關(guān)系分析

利用30對(duì)引物在5個(gè)樣品中獲得157條擴(kuò)增片段，如表2。在NTSYS軟件中計(jì)算樣品間的遺傳相似系數(shù)(GS值)，得到供試材料遺傳相似矩陣。遺傳相似系數(shù)越大，表明親緣關(guān)系越近，遺傳相似系數(shù)越小，表明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。由表3可知，5個(gè)樣品的GS值范圍為：0.6433～0.7707，變幅為0.1274。其中江蘇興化樣品和黑龍江賓縣樣品之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.6433，表明這兩個(gè)樣品之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異性大。江蘇興化樣品和江蘇宿遷樣品之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.7707，表明江蘇興化樣品和江蘇宿遷樣品之間的親緣關(guān)系較近，遺傳差異性較小。

表3 5個(gè)不同地理群體之間的遺傳相似系數(shù)矩陣

2.3 RAPD分子標(biāo)記聚類(lèi)分析

利用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，根據(jù)遺傳相似系數(shù)對(duì)各樣品進(jìn)行分類(lèi)分析，聚類(lèi)圖如圖3，從得到的聚類(lèi)分析圖上可以看出，5個(gè)樣品分成2類(lèi)，江蘇興化、江蘇宿遷、江蘇吳江、湖北大悟縣是第一類(lèi)，黑龍江賓縣是第二類(lèi)。其中第一類(lèi)又分為2個(gè)亞類(lèi)，第一亞類(lèi)為江蘇興化、江蘇宿遷，第二亞類(lèi)為江蘇吳江、湖北大悟縣。

圖3 UPGMA聚類(lèi)分析法構(gòu)建的不同群體寬體金線蛭的譜系關(guān)系

2.4 不同地理種群生長(zhǎng)指標(biāo)

仔蛭生長(zhǎng)指標(biāo)：由表4可見(jiàn)，黑龍江賓縣仔蛭的平均體質(zhì)量從11日齡開(kāi)始顯著低于(P<0.05)其它4個(gè)地區(qū)的平均體質(zhì)量，生長(zhǎng)較慢；江蘇宿遷仔蛭11日齡的平均體質(zhì)量顯著低于(P<0.05)江蘇吳江地區(qū)的11日齡平均體質(zhì)量。不同地理種群仔蛭前16 d的平均日增重均較平穩(wěn)，從16 d到21 d的平均日增重均出現(xiàn)較前16 d的3～5倍增長(zhǎng)。不同地理種群仔蛭的相對(duì)增重率和特定增重率均在6 d時(shí)較高，11 d和16 d依次下降，并在16 d時(shí)達(dá)到最低值，之后迅速增長(zhǎng)，21 d時(shí)再次到達(dá)一個(gè)峰值(見(jiàn)圖4)。

幼蛭生長(zhǎng)指標(biāo)：由表5可見(jiàn)，黑龍江賓縣幼蛭平均體質(zhì)量從31 d就出現(xiàn)了顯著低于(P<0.05)其他地區(qū)幼蛭平均體質(zhì)量，其生長(zhǎng)速率較慢。所有地區(qū)的幼蛭在1 d到61 d和91 d到121 d 期間的平均日增重基本差別不大，但61 d到91 d期間的平均日增重出現(xiàn)了零增長(zhǎng)或極少量增長(zhǎng)。相對(duì)增重率和特定增重率均呈現(xiàn)在31 d時(shí)最高，之后迅速下降，到91 d時(shí)達(dá)最低值，然后再呈增長(zhǎng)趨勢(shì)(見(jiàn)圖5)。

表4 不同地理種群寬體金線蛭仔蛭不同日齡生長(zhǎng)性狀比較

注：同列數(shù)字字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

表5 不同地理種群寬體金線蛭幼蛭不同日齡生長(zhǎng)性狀比較

圖5 不同地理種群寬體金線蛭幼蛭121日齡生長(zhǎng)曲線

3 討論

3.1 水蛭群體的遺傳多樣性

本研究的5個(gè)地理種群均為野生群體。結(jié)果表明，從遺傳相似系數(shù)來(lái)看江蘇和湖北群體間的遺傳差距較小，其中江蘇境內(nèi)宿遷和興化兩個(gè)群體遺傳差距最小，遺傳相似系數(shù)為0.7707，江蘇太湖和湖北大悟縣群體次之，遺傳相似系數(shù)為0.7643，江蘇興化和黑龍江賓縣群體間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.6433。聚類(lèi)分析顯示，江蘇地區(qū)3個(gè)群體和湖北大悟縣群體聚為第一大類(lèi)，黑龍江賓縣群體聚為第二大類(lèi)，其中第一大類(lèi)中江蘇興化和江蘇宿遷群體聚為第一亞類(lèi)，江蘇吳江和湖北大悟縣群體聚為第二亞類(lèi)。可見(jiàn)，遺傳距離與實(shí)際的地理距離是有一定的相關(guān)性的。

梁超等[17]、蔣速飛等[18]、楊慧榮[19]等用RAPD技術(shù)分別研究了魁蚶(Scaphareabroughtonii)、日本沼蝦(Macmbrachiumnipponensis)、黑鯛(Sparusmacrocephalus)不同地理群體的遺傳變異，群體間的遺傳相似系數(shù)為0.842～0.994。相比之下，寬體金線蛭不同地理群體的遺傳相似系數(shù)值較低，相互之間的遺傳差異較大。

3.2 不同地理種群生長(zhǎng)指標(biāo)

寬體金線蛭的生長(zhǎng)速度主要與環(huán)境溫度和適口餌料相關(guān)。生長(zhǎng)試驗(yàn)中，不同地理種群仔蛭的生長(zhǎng)溫度控制在其最適宜生長(zhǎng)溫度25 ℃左右，餌料以浮游生物和適口田螺為主，5個(gè)地理種群21 d成活率均高達(dá)90%以上，說(shuō)明此環(huán)境非常適合寬體金線蛭幼蛭生長(zhǎng)，這一結(jié)果與王宣朋等[20]、熊良偉等[21]的研究基本一致。

在幼蛭的成活率和生長(zhǎng)試驗(yàn)中，前61 d各地區(qū)幼蛭成活數(shù)量均很高，基本沒(méi)有死亡，但在61～91 d期間死亡數(shù)量急劇上升，91 d時(shí)黑龍江賓縣和湖北大悟縣幼蛭僅剩53條、65條存活，江蘇3個(gè)地區(qū)寬體金線蛭成活數(shù)量也僅剩85～87條。當(dāng)水溫從20 ℃升到27 ℃，寬體金線蛭生長(zhǎng)正常，成活數(shù)量很高，但是當(dāng)氣溫達(dá)到36 ℃，池塘水溫在32 ℃左右，高溫一直持續(xù)10 d左右時(shí)，各地區(qū)幼蛭均出現(xiàn)了停止攝食甚至死亡的現(xiàn)象，之后開(kāi)始向池塘內(nèi)24 h不間斷加注新鮮井水，使池塘水溫控制在27 ℃左右，各地區(qū)幼蛭死亡得到控制，這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證寬體金線蛭生長(zhǎng)對(duì)溫度條件的要求。本試驗(yàn)中，121 d時(shí)江蘇省3個(gè)地區(qū)幼蛭成活率為70%左右，明顯高于湖北大悟縣(53.33%)和黑龍江賓縣(44.17%)，這可能跟原生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。王安綱指出，在其他條件不變的情況下，固著、隱蔽棲息和食物是構(gòu)成寬體金線蛭分布的三大要素[22]。首先，江蘇省3個(gè)地區(qū)幼蛭均采自湖泊，地區(qū)間氣候差別不大，而湖北大悟縣和黑龍江賓縣的野生寬體金線蛭分別采自山溪、松花江等河流水域，常年水溫較低，這使得后者繁殖時(shí)間較前者晚，或者繁殖溫度較低，因此在江蘇省宿遷市的養(yǎng)殖不利于其繁殖習(xí)性；其次，江蘇省3個(gè)地區(qū)寬體金線蛭食物組成相似，但與湖北大悟縣和黑龍江賓縣相比，食物組成差別較大，其對(duì)寬體金線蛭的發(fā)育情況也會(huì)產(chǎn)生一定的影響；再次，江蘇省湖泊與湖北和黑龍江河流中寬體金線蛭固著、隱蔽棲息的介質(zhì)不同，其對(duì)寬體金線蛭生長(zhǎng)也存在一定的影響。

黑龍江賓縣的仔蛭和幼蛭平均體質(zhì)量均表現(xiàn)出了顯著低于(P<0.05)其他地區(qū)幼蛭平均體質(zhì)量，說(shuō)明黑龍江賓縣地區(qū)的寬體金線蛭確實(shí)生長(zhǎng)速度較慢。

綜上，基于本研究結(jié)果，目前江蘇3個(gè)地區(qū)的寬體金線蛭生長(zhǎng)速度較快，是比較適合本地區(qū)養(yǎng)殖的，在寬體金線蛭的養(yǎng)殖購(gòu)種時(shí)，最好選擇與本地環(huán)境相近的親本和蛭苗。結(jié)合RAPD研究結(jié)果，江蘇地區(qū)的品種遺傳距離較小，鑒于其生長(zhǎng)較快的性狀，在今后的水蛭育種工作中可以對(duì)其抗病性等相關(guān)性狀進(jìn)行種質(zhì)改良。