焦義然，陳文燁，楊 帆，劉永偉，董福雙，杜進民，周 碩*

(1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 遺傳生理研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，河北 石家莊 050051)

植物由營養(yǎng)生長到生殖生長離不開一個重要的過程，即開花相關(guān)基因的表達[1]。對于植物的成花誘導(dǎo)途徑主要有6種，分別是光周期(Photoperiod)、春化(Vernalization)、赤霉素(Gibberellin)、 自主調(diào)節(jié)(Self-regulation)、年齡依賴(Age dependence)和溫敏(Temperature sensitive)[2-3]。許多研究表明，開花是由FT(Flowering Locus T)基因及其同源物來調(diào)節(jié)的[4-6]。在模式植物擬南芥FT基因研究中，發(fā)現(xiàn)其編碼產(chǎn)物能長距離轉(zhuǎn)運成花激素，對花的形成具有決定作用[7-8]。小葉楊具有兩個FT同源基因，分別是FT1和FT2，40 d內(nèi)轉(zhuǎn)基因楊樹具有開花能力[9]。山葡萄FT基因的表達高峰出現(xiàn)于花序剛開始展露期，在花的前期形成過程中可能具有調(diào)控作用[10]。番茄和煙草FT基因的過表達能導(dǎo)致開花期提前，楊樹FT同源基因轉(zhuǎn)化到模式植物擬南芥中，造成擬南芥對光周期不敏感，以至開花期的提前[11-13]。FT基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)對其功能具有決定作用，且大多數(shù)氨基酸殘基的突變對開花不存在顯著影響，即為FT基因序列的多樣性[14]。在長期進化過程中，不同植物FT同源基因為適應(yīng)各自的生態(tài)環(huán)境具有不同的功能[15-16]。在植物界中，同一個基因的多功能現(xiàn)象是普遍存在的，且進化形成的復(fù)制加倍也能造成植物基因組中基因多拷貝的結(jié)果[17-18]。某種物種基因的核苷酸或蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)功能可以通過生物信息學(xué)分析得出，本研究利用生物信息方法分析小麥FT基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、信號肽、跨膜區(qū)、亞細胞定位，并通過同源建模的方法預(yù)測小麥FT基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)，并對不同植物FT基因編碼蛋白的功能位點、密碼子使用偏性和系統(tǒng)發(fā)育進行分析。對小麥FT蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)，并為研究不同植物FT基因在進化過程中的保守性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

如表1所示，不同植物的序列來源于NCBI的核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，通過登錄號可查詢不同植物FT基因的序列信息。利用ProtParam在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對21種植物FT基因理化性質(zhì)進行分析，同時通過Protscale在線軟件(http://web.expasy.org/protscale/)分析小麥FT基因編碼蛋白親水性，通過CFSSP(http://www.biogem.org/tool/chou-fasman/)、SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Prosite(http://prosite.expasy.org/)和TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)等在線軟件對小麥FT基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、模塊和亞細胞定位進行分析，通過SSWISS MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)中的同源建模預(yù)測小麥FT基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)，通過CodonW和MEGA軟件中的最大似然法分析21種不同植物FT基因的密碼子偏性和系統(tǒng)發(fā)育。

表1 不同植物FT基因編碼蛋白信息

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥FT基因編碼蛋白理化性質(zhì)的分析

小麥FT基因共編碼177個氨基酸，如圖1所示，纈氨酸(V)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)在FT基因編碼氨基酸中所占比例最高，分別是11.3%、9.6%和9.6%。等電點為7.73，分子量為19849.55，含有17個帶負電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)，18個帶正電荷氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)，分子式為C876H1357N253O256S10，總原子數(shù)為2752。當(dāng)全部Cys形成為胱氨酸，其消光系數(shù)為1.086，不能形成胱氨酸的消光系數(shù)為1.080。其余20種植物FT基因編碼蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)和親水性總平均值如表1所示，小麥的脂肪族氨基酸指數(shù)最低，為70.9，擬南芥為88.97，位居最高；不穩(wěn)定指數(shù)最低的是番茄，其次是小麥，最高的是大蒜，表明小麥和番茄相比其他植物相對較為穩(wěn)定；本研究中所選取的多種植物的親水性總平均值均為負值，其中大豆的親水性最低，而黑楊的親水性最高，上述結(jié)果均表明植物FT基因為親水性的脂溶性蛋白質(zhì)。

圖1 小麥FT基因編碼蛋白氨基酸組成成分

2.2 小麥FT基因編碼蛋白疏水性/親水性的分析

如圖2所示，通過Hphob./Kyte&Doolittle方法對小麥FT基因編碼蛋白序列的疏水性分析得知該蛋白為親水性蛋白，與理化性質(zhì)中預(yù)測結(jié)果一致。第121個氨基酸(V)和第124個氨基酸(L)得分最高，均為2.044，第142個氨基酸(F)得分最低，為-2.422，大多數(shù)氨基酸得分為負值，表明小麥FT基因編碼的多肽鏈為親水性蛋白。

圖2 小麥FT基因編碼蛋白的疏/親水性分析結(jié)果

2.3 小麥FT基因編碼蛋白的α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角分析

如圖3所示，通過Chou&Fasman方法對小麥FT基因編碼蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)分析得知該蛋白主要以β折疊(beta-sheet)為主，共120個氨基酸，其次是α螺旋(alpha-helix)，共84個氨基酸，上述兩個結(jié)構(gòu)域在整條肽鏈中分布較為均勻，結(jié)構(gòu)域中最少的為β轉(zhuǎn)角(beta-turn)，共26個氨基酸，在整條肽鏈中主要分布在N端和C端兩端，主要分布在第74～81個氨基酸和第109～113個氨基酸兩個區(qū)域內(nèi)。

圖3 小麥FT基因編碼蛋白的α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角的預(yù)測結(jié)果

2.4 小麥FT基因編碼蛋白的信號肽和跨膜結(jié)果與分析

如圖4所示，小麥FT基因前70個氨基酸中不存在典型的信號肽趨勢，最高的C-score(raw cleavage site score)為0.144，最高的Y-score(combined cleavage site score)為0.122，最高的S-score(signal peptide score)為0.172，其中第1～10個氨基酸的平均切割點值為0.124，表明小麥FT基因不存在信號肽。如圖5所示，小麥FT基因編碼蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，表明小麥FT基因編碼產(chǎn)物為非跨膜蛋白。

2.5 不同植物FT基因編碼蛋白功能位點的分析

如表2所示，除滿天星外，其余20種植物均存在PEBP(Phosphatidylethanolamine-binding protein family signature)蛋白，雖然不同植物編碼FT基因蛋白長度不一致，但PEBP蛋白所在區(qū)域極為保守，其中第65～87個氨基酸(YTLVMVDPDAPSPSDPNLREYLH)為小麥PEBP蛋白。

2.6 不同植物FT基因密碼子偏性指數(shù)的分析

如表2所示，小麥的有效密碼子數(shù)(ENc=35.27)均低于其他20種植物，而蘋果的ENc值最高(ENc=61)，表明小麥對密碼子的使用具有更強的偏性，而蘋果不存在密碼子偏性；小麥的GC含量(GC=0.627)和密碼子第三位的GC含量最高(GCs=0.815)，其次是臭菘，但番茄的GC含量(GC=0.367)最低，馬鈴薯的密碼子第三位的GC含量(GCs=0.299)最低，牽牛的最優(yōu)密碼子使用頻率(CBI=0.153)最高，其次是小麥(CBI=0.15)，最低的是番木瓜(CBI=-0.176)。

2.7 小麥FT基因編碼蛋白的亞細胞定位分析

如表3所示，小麥FT基因編碼產(chǎn)物在線粒體中的分布最高，所占比例為18.9%，其次是作為分泌通路信號肽，但絕大部分編碼蛋白分布在其他區(qū)域，且無具體描述。

2.8 小麥FT基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)分析及其功能預(yù)測

如圖6所示，利用同源建模(預(yù)測模板為3axy.1.A)對小麥FT基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行構(gòu)建，此模板與小麥FT基因編碼蛋白序列的相似度為89.57%。

2.9 不同植物FT基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

如圖7所示，不同植物FT基因的聚類關(guān)系主要分為三簇，番木瓜、蘋果、樺樹、葡萄和滿天星與萵苣、荔枝、油菜、牡丹和黑楊聚為一簇，大蒜、牽牛、小麥、臭菘和春劍蘭花聚為一簇，上述兩簇與三花龍膽聚為一大簇，再與馬鈴薯、番茄、大豆、擬南芥和白芥聚為一簇，簇內(nèi)的親緣關(guān)系高于簇間。聯(lián)系密碼子偏性相關(guān)分析，得出番木瓜、蘋果、樺樹、葡萄和滿天星對FT基因密碼子使用偏性具有一致性，且蘋果的有效密碼子數(shù)為61，表明蘋果對密碼子使用不存在偏性，且PBP位點具有絕對保守性，萵苣、荔枝、油菜、牡丹和黑楊對FT基因密碼子使用偏性也具有一致性。這說明密碼子偏性間的相似關(guān)系與系統(tǒng)發(fā)育分析得出的親緣關(guān)系具有一致性。

圖5 小麥FT基因編碼蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測結(jié)果

物種氨基酸個數(shù)PEBP位點ENcGCGCsCBI小麥(Triticum aestivum)17765-8735.270.6270.8150.15大蒜(Allium sativum)17563-8549.230.4690.4040.023大豆(Glycine max)17464-8649.270.4710.4190.047臭菘(Symplocarpus renifolius)17363-8549.170.5690.6690.122馬鈴薯(Solanum tuberosum)17464-8647.910.4320.299-0.085番木瓜(Carica papaya)17464-8644.930.4440.341-0.176萵苣(Lactuca sativa)17565-8759.290.4840.429-0.021樺樹(Betula platyphylla)17464-8649.640.5250.541-0.067三花龍膽(Gentiana triflora)17565-8758.870.4970.450.058牡丹(Paeonia suffruticosa)17364-8652.840.4870.444-0.072蘋果(Malus domestica)17464-86610.50.465-0.052牽牛(Ipomoea nil)17464-8655.120.5380.5330.153油茶(Camellia oleifera)17969-9147.480.5010.454-0.022擬南芥(Arabidopsis thaliana)17565-8752.780.4550.392-0.072葡萄(Vitis vinifera)17464-8650.380.50.465-0.029春劍蘭花(Cymbidium goeringii)17664-8657.370.5130.497-0.068荔枝(Litchi chinensis)17464-8656.30.4980.5-0.072黑楊(Populus nigra)17464-8660.580.5040.4970.017白芥(Sinapis alba)17565-8754.130.480.424-0.094滿天星(Gypsophila paniculata)178no53.820.5010.462-0.008番茄(Solanum lycopersicum)17562-8457.410.3670.369-0.146

表3 小麥FT基因編碼蛋白的亞細胞定位結(jié)果

3 討論

植物FT蛋白是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein， PEBP)家族成員之一，對開花具有促進作用[19]。在高等植物花發(fā)育研究中，F(xiàn)T基因是目前作為調(diào)控植物開花的研究熱點[14，20-23]。如擬南芥FT蛋白與具有晝夜變化的卵磷脂結(jié)合來促進開花[21]。被子植物FT基因?qū)﹂_花具有調(diào)控作用，木本植物FT基因?qū)庵芷诘臓I養(yǎng)生長也具有調(diào)控作用[7]。不同植物FT基因編碼蛋白的基本功能具有較高的保守性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)小麥等植物FT基因編碼蛋白長度相似，小麥FT基因編碼產(chǎn)物為一種親水性的脂溶性蛋白質(zhì)，不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。菊花FT基因編碼蛋白含有FT類蛋白保守基序和2個關(guān)鍵性的氨基酸殘基[25]。荔枝具有兩個FT同源基因，分別是FT1和FT2基因，兩個同源基因間存在少數(shù)的堿基差異，但編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)相似度較高，二級機構(gòu)中的α螺旋和β折疊數(shù)量一樣，但對功能分化還有待研究[26]。本研究發(fā)現(xiàn)小麥FT基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是由β折疊為主，其次分別是α螺旋和β轉(zhuǎn)角，這與荔枝FT蛋白不一致。密碼子偏好性研究發(fā)現(xiàn)小麥對密碼子使用具有較強的偏好性，且不同植物間密碼子偏好性的相似關(guān)系與基于最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育分析的親緣關(guān)系具有一致性。黃瑋婷等[27]發(fā)現(xiàn)墨蘭FT基因與春蘭、建蘭等植物相比，具有較高的保守性和同源性。黑果枸杞和寧夏枸杞的FT基因同源性高達98%，與馬鈴薯和煙草FT基因編碼蛋白也具有極高的相似度，同時黑果枸杞和寧夏枸杞的FT基因編碼蛋白具有相同的PEBP結(jié)構(gòu)域[28]。本研究發(fā)現(xiàn)除滿天星外，其余植物均具有PEBP結(jié)構(gòu)域，盡管不同植物FT基因編碼蛋白長度不一致，但是PEBP結(jié)構(gòu)域具有極強的位置保守性。劉新宇等[29]發(fā)現(xiàn)茄子FT蛋白定位于細胞質(zhì)中，與番茄FT蛋白定位結(jié)果不一致[30]，有研究表明，不同品種FT基因及其同源基因定位是存在差異的[31]。本研究發(fā)現(xiàn)小麥FT基因編碼蛋白主要位于線粒體，但該定位與其功能是否具有相關(guān)性，還需要進一步實驗驗證。

圖6 小麥FT基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

圖7 不同植物FT基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法分析小麥FT基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)現(xiàn)小麥FT蛋白由177個氨基酸組成，其編碼產(chǎn)物為一種親水性的脂溶性蛋白質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)主要是由β折疊為主，其次分別是α螺旋和β轉(zhuǎn)角，無信號肽和跨膜區(qū)，主要存在于線粒體中，小麥FT基因?qū)γ艽a子的使用具有極強的偏好性，尤其偏愛使用G/C堿基，通過同源建模對其蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，同源性高達89.57%，比較不同植物FT基因?qū)γ艽a子的使用情況發(fā)現(xiàn)密碼子偏性間的相似關(guān)系與系統(tǒng)發(fā)育分析得出的親緣關(guān)系具有一致性，且大多數(shù)植物均具有PEBP蛋白，為FT基因的結(jié)構(gòu)和功能研究提供理論基礎(chǔ)。