喬永祥，謝晶，雷昊

(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海,201306)

生菜又稱葉用萵苣，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富綠色健康的綠葉蔬菜，由于生菜中富含維生素、碳水化合物和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，常作為蔬菜沙拉食用[1-2]。生菜經(jīng)過(guò)切割等處理加速了生理劣變，貯藏過(guò)程的酶促褐變是最常見(jiàn)的問(wèn)題之一，嚴(yán)重影響鮮切產(chǎn)品的感官品質(zhì)[3]。目前對(duì)于抑制褐變的物理化學(xué)方法有很多，抗壞血酸、胱氨酸、檸檬酸、草酸和1-甲基環(huán)丙烯等化學(xué)試劑[4]已被前人證明可以很好地抑制酶促褐變，然而這些化學(xué)防褐變方法提高了產(chǎn)品成本并且效率低[2]；熱處理、輻射等物理處理雖然對(duì)抑制褐變也有一定的效果，但這些物理處理方式損害了產(chǎn)品的感官特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5]。因此急需一種新的抑制褐變的方法替代原有的方法。

油菜素內(nèi)酯(24-epibrassinolide，EBR)是一種由植物多羥基構(gòu)成的，并被確認(rèn)為一種新的天然無(wú)毒無(wú)害植物激素，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用的物質(zhì)，其存在于多種植物的器官中，參與很多生理和生化過(guò)程，是調(diào)節(jié)各種生理過(guò)程必不可少的物質(zhì)[6]。有研究表明適當(dāng)濃度的外源油菜素內(nèi)酯處理還能有效緩解各種生物、非生物脅迫對(duì)植物造成的氧化損傷[7]，有效地維持采后果蔬的品質(zhì)質(zhì)量。ZHU等[8]將棗果在5 μmol/L油菜素內(nèi)酯溶液中浸泡5 min可以很好地抑制青霉病，維持良好的外觀；GAO等[9]研究發(fā)現(xiàn)茄子經(jīng)過(guò)油菜素內(nèi)酯浸泡10 min可以很好地降低多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶等活性，從而在貯藏期間抑制茄子果肉的褐變，延長(zhǎng)貨架期；同時(shí)GAO等[10]以鮮切藕片為試驗(yàn)對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)用80 nmol/L的油菜素內(nèi)酯溶液浸泡10 min可以有效地抑制酚類代謝和與褐變相關(guān)酶活性如多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等，從而降低鮮切藕片表面褐變。

目前還沒(méi)有人將油菜素內(nèi)酯用于抑制鮮切生菜的褐變。因此本試驗(yàn)主要以鮮切生菜為研究對(duì)象，探討在貯藏過(guò)程中外源油菜素內(nèi)酯處理對(duì)鮮切生菜褐變的影響，通過(guò)研究其對(duì)感官品質(zhì)、褐變指數(shù)以及褐變相關(guān)酶的酶活性的影響，從而更好地理解油菜素內(nèi)酯在抗褐變中的作用，并提供一種鮮切生菜保持品質(zhì)質(zhì)量和延長(zhǎng)保質(zhì)期的新工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮生菜：購(gòu)自上海市浦東新區(qū)臨港新城某菜市場(chǎng)，挑選顏色鮮亮、脆嫩、無(wú)腐爛蟲害、大小一致的生菜為試驗(yàn)原料。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)(H-2050R-1型)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；冰箱(BCD-252MHV型)，蘇州三星電子有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(WFZ UV-2100)，上海龍尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生菜預(yù)處理

將新鮮購(gòu)買的生菜及時(shí)進(jìn)行處理，挑選光鮮飽滿、大小均勻、無(wú)蟲害無(wú)缺損的生菜，將其切成3～5 cm小段，分別于自來(lái)水、5 μmol/L EBR、15 μmol/L EBR溶液(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果確定)中浸泡10 min，記為CK、A、B組，撈出在通風(fēng)陰涼處瀝干1 h。本試驗(yàn)選取鮮切生菜葉脈[11]為研究對(duì)象，將浸泡好的鮮切生菜葉脈盛放在塑料托盤中，每個(gè)托盤80 g左右，并用保鮮膜封口，貯藏在(4±1) ℃冰箱中，每組大約準(zhǔn)備8～10盒，以備后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。每次實(shí)驗(yàn)每組樣品隨機(jī)選擇3盒，測(cè)量其褐變指數(shù)、多酚氧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性、脂氧合酶活性、丙二醛含量以及感官品質(zhì)評(píng)分。

1.3.2 感官質(zhì)量評(píng)價(jià)

參照KING等[12]的方法，并稍加修改：每次邀請(qǐng)3名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)具有一定蔬菜感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的葉菜感官評(píng)價(jià)員組成評(píng)定小組，采用數(shù)字化評(píng)分方法(1～9分)對(duì)各試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判別打分：9分為色澤鮮艷，質(zhì)地脆嫩，切口無(wú)褐變；7分為色澤較鮮艷，切口出現(xiàn)輕微褐變；5分為貨架期終點(diǎn)，表現(xiàn)為色澤黯淡，切口褐變面積擴(kuò)大；3分為切口褐變嚴(yán)重，葉片萎蔫，有異味；1分為嚴(yán)重腐爛，有異味。

1.3.3 褐變指數(shù)的測(cè)定

參考KIM等[13]略有修改，取2個(gè)生菜葉片組織，將其浸入40 mL蒸餾水和10 mL 10%三氯乙酸的混合溶液，室溫放置2 h后進(jìn)行過(guò)濾。以蒸餾水作為對(duì)照，在420 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)測(cè)量濾液的吸光度。

1.3.4 多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)活性測(cè)定

參照Z(yǔ)HAN等[14]測(cè)定方法在480 nm處測(cè)定其吸光度。

1.3.5 過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)活性測(cè)定

參照Z(yǔ)HOU等[15]測(cè)定方法在420 nm處測(cè)定其吸光度。

1.3.6 苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)活性測(cè)定

在290 nm處測(cè)定其吸光度[16]。

1.3.7 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的測(cè)定

分別在450、532和600 nm測(cè)定其吸光度[17]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

各指標(biāo)均做3次平行，均采用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；用Origin 8.6軟件繪圖，應(yīng)用SPSS Statistics 19.0進(jìn)行差異顯著分析(p<0.05為差異顯著 )。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切生菜感官品質(zhì)的變化

由圖1可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組的樣品感官評(píng)分逐漸降低，其中對(duì)照組樣品感官品質(zhì)衰敗的最快，貯藏第3天，鮮切生菜在切口處出現(xiàn)輕微褐變，在第6天，切口處的褐變面積擴(kuò)大，鮮切生菜葉片略微變黃萎蔫，在第9天，鮮切生菜切口褐變嚴(yán)重，葉片萎蔫，已有腐爛跡象，失去食用價(jià)值，這是可能是因?yàn)樯私?jīng)切割處理后造成組織結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生，從而引起一系列的生理變化如菜葉褐變、黃化[18]。處理組B與對(duì)照組差異顯著(p<0.05)，在貯藏第9天，感官評(píng)評(píng)分為8.3，葉片柔嫩鮮綠，切口處表現(xiàn)出輕微褐變，在第12天，感官品質(zhì)急劇下降，切口褐變嚴(yán)重，褐變面積增大，葉片萎蔫黃化，失去食用價(jià)值。SERNA等[19]研究發(fā)現(xiàn)香蕉果皮葉綠素降解相關(guān)的過(guò)氧化物酶活性異常高是香蕉果皮褐變的原因之一，因此推斷這可能是由于EBR處理抑制了其過(guò)氧化物酶活性，提高了鮮切生菜的抗逆性，從而保護(hù)了鮮切生菜鮮亮的色澤，使其保持良好的感官品質(zhì)[20]。由此可見(jiàn)一定濃度的EBR處理可以保護(hù)鮮切生菜良好的外觀，抑制切口的褐變速度。

圖1 油菜素內(nèi)酯對(duì)鮮切生菜感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of 24-epibrassinolide on sensory quality of fresh-cut lettuce

2.2 鮮切生菜褐變指數(shù)的變化

褐變指數(shù)通常被認(rèn)為是一種間接的度量指標(biāo)，用來(lái)反映由褐變反應(yīng)生成的可溶性色素化合物含量，從而反映果蔬褐變程度[13]。貯藏期間鮮切生菜褐變指數(shù)的變化情況如圖2所示，由圖2可以看出隨著貯藏時(shí)間的增加，各處理組褐變指數(shù)呈上升趨勢(shì)，其中對(duì)照組褐變指數(shù)急劇上升，對(duì)照組CK和處理組A之間差異不顯著(p>0.05)，第6天處理組B與處理組A差異顯著(p<0.05)。在貯藏前期處理組B的褐變指數(shù)變化幅度不大，在第9天褐變指數(shù)為0.022，而CK組為0.042，貯藏末期褐變指數(shù)為0.064仍處于較低水平，而CK組為0.091，這可能是由于油菜素內(nèi)酯附著在切口表面在一定程度上隔絕了環(huán)境中的氧氣，從而抑制了褐變的產(chǎn)生[21]，因此一定濃度的油菜素內(nèi)酯溶液可以抑制鮮切生菜切口褐變，維持鮮切生菜鮮亮的外觀。

圖2 油菜素內(nèi)酯對(duì)鮮切生菜褐變指數(shù)的影響Fig.2 Effects of 24-epibrassinolide on browning index of fresh-cut lettuce

2.3 鮮切生菜多酚氧化酶活性的變化

多酚氧化酶(PPO)是導(dǎo)致酶促褐變的主要酶，組織內(nèi)的酚類物質(zhì)被氧化為醌，形成褐色色素，參與褐變反應(yīng)[22]，一般多酚氧化酶活性越高，褐變程度越大，因此PPO活性可以作為衡量預(yù)測(cè)褐變敏感性的一個(gè)指標(biāo)。

圖3 油菜素內(nèi)酯對(duì)鮮切生菜多酚氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of 24-epibrassinolide on polyphenol oxidase activity of fresh-cut lettuce

由圖3可以看出，各處理組均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，其中各處理差異顯著(p<0.05)，對(duì)照組CK在貯藏前期PPO活性急劇上升，最高為30.14 U/g，這可能是因?yàn)轷r切處理造成生菜細(xì)胞組織被破壞，增大了與氧氣接觸的面積，加速褐變反應(yīng)速度，在貯藏第12天，PPO活性迅速下降，這可能是由于隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，酶促反應(yīng)的底物不斷減少，導(dǎo)致酶活性降低[23]。貯藏末期CK組的PPO活性為16.98 U/g，比處理組B高32%，這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)油菜素內(nèi)酯處理減少了切口表面多酚氧化酶和酚類物質(zhì)的接觸，抑制了酶促褐變反應(yīng)的進(jìn)行[10]。處理組A對(duì)于PPO活性的抑制效果不如B組，可能是因?yàn)橛筒怂貎?nèi)酯溶液濃度過(guò)低。

2.4 鮮切生菜過(guò)氧化物酶活性的變化

植物體內(nèi)的過(guò)氧化物酶(POD)是以單或雙酚類化合物為底物合成的[2]，而酶促褐變的重要底物是酚類物質(zhì)，有研究表明在植物組織中，POD通常協(xié)同PPO引起鮮切果蔬的酶促褐變[24]，因此POD活性也是衡量褐變的一個(gè)重要指標(biāo)。圖4為貯藏期間鮮切生菜POD活性的變化情況，由圖4可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)POD活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，其中各處理組表現(xiàn)出差異性(p<0.05)，油菜素內(nèi)酯處理顯著提高了POD活性，在貯藏末期處理B組的POD活性為15.88 U/g，是對(duì)照組的1.09倍，這可能是因?yàn)橛筒怂貎?nèi)酯處理可以增加 WRKY30 轉(zhuǎn)錄因子和防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而導(dǎo)致POD活性顯著提高，清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧的能力增強(qiáng)，避免了活性氧的積累，從而達(dá)到抑制褐變的目的[25]。這與GAO和唐如雪等[10,20]研究的油菜素內(nèi)酯處理提高了POD活性結(jié)果相一致。

圖4 油菜素內(nèi)酯對(duì)鮮切生菜過(guò)氧化物酶活性的影響Fig.4 Effects of 24-epibrassinolide on peroxidase activity of fresh-cut lettuce

2.5 鮮切生菜苯丙氨酸解氨酶活性的變化

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是酚類物質(zhì)合成的主要酶類之一，在一定程度上由于酚類化合物的積累，導(dǎo)致PAL活性增加，促進(jìn)鮮切果蔬褐變反應(yīng)的進(jìn)行，因此PAL活性與鮮切果蔬褐變有著密切的關(guān)系。由圖5可以看出，對(duì)照組CK在貯藏前期PAL活性急劇上升，在第6天達(dá)到2.28 U/g，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)PAL活性逐漸開始下降，而處理組B在整個(gè)貯藏過(guò)程中PAL活性變化不大，與CK組差異顯著(p<0.05)，在貯藏末期PAL活性為1.22 U/g，比CK組低30%，這可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)油菜素內(nèi)酯處理使其組織內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫量減少，從而抑制了PAL的活性[9]。該結(jié)果與李麗花等[26]研究的油菜素內(nèi)酯處理可以顯著提高杏果實(shí)中PAL活性的結(jié)果想類似，這說(shuō)明油菜素內(nèi)酯處理對(duì)鮮切生菜組織的褐變具有保護(hù)作用。

圖5 油菜素內(nèi)酯對(duì)鮮切生菜苯丙氨酸解氨酶活性的影響Fig.5 Effects of 24-epibrassinolide on penylalanine ammonia lyase activity of fresh-cut lettuce

2.6 鮮切生菜丙二醛含量的變化

鮮切果蔬經(jīng)過(guò)鮮切處理使切口組織的膜受到損傷，加快膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，從而促進(jìn)褐變的進(jìn)行，丙二醛作為膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，能用來(lái)衡量和評(píng)價(jià)蔬菜膜系統(tǒng)受傷害的程度。由圖6可以看出，在貯藏期間各處理鮮切生菜的丙二醛含量呈上升趨勢(shì)，其中對(duì)照組上升趨勢(shì)尤為顯著，處理組A和對(duì)照組CK差異不顯著(p>0.05)，這可能是因?yàn)榍懈钐幚韺?duì)生菜造成損害脅迫[27]，而處理組A的油菜素內(nèi)酯濃度過(guò)低，不能對(duì)鮮切生菜的切口起到保護(hù)作用，從而使丙二醛含量沒(méi)有表現(xiàn)出明顯變化；處理組A和處理組B從第6天開始表現(xiàn)出差異性(p<0.05)，在貯藏末期處理組B丙二醛含量仍處于較低水平，比對(duì)照組少了28.57%，這是因?yàn)橛筒怂貎?nèi)酯處理可以調(diào)節(jié)植物組織內(nèi)抗氧化酶的活性，維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡，降低膜脂過(guò)氧化物MDA的產(chǎn)生[28]。這與WU等[29]研究的油菜素內(nèi)酯處理可以抑制茄子中丙二醛含量的增加結(jié)果相一致。因此一定濃度的油菜素內(nèi)酯溶液可以延緩鮮切生菜丙二醛含量的積累，減少細(xì)胞組織的破裂，避免褐變發(fā)生。

圖6 油菜素內(nèi)酯對(duì)鮮切生菜丙二醛含量的影響Fig.6 Effects of 24-epibrassinolide on MDA content of fresh-cut lettuce

3 結(jié)論

鮮切生菜經(jīng)過(guò)鮮切處理后，一方面造成機(jī)械損傷，增強(qiáng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化，促使丙二醛的含量積累增加，細(xì)胞破裂，氧氣與酚類物質(zhì)接觸，加速褐變；另一方面鮮切可以誘導(dǎo)苯丙氨酸解氨酶活性，也與褐變有一定的因果關(guān)系[13]。本試驗(yàn)以油菜素內(nèi)酯浸泡10 min的鮮切生菜為試驗(yàn)材料，以自來(lái)水清洗為對(duì)照組，研究貯藏期間油菜素內(nèi)酯對(duì)鮮切生菜褐變的影響。結(jié)論如下：

在貯藏期間，對(duì)照組中鮮切生菜在第9天，切口褐變嚴(yán)重，葉片萎蔫，已有腐爛跡象，失去食用價(jià)值，而油菜素內(nèi)酯處理效果明顯優(yōu)于對(duì)照組，其中用15 μmol/L油菜素內(nèi)酯處理鮮切生菜效果尤為顯著，在貯藏期間可以很好地抑制多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，提高過(guò)氧化物酶的活性，延緩了丙二醛含量的積累，抑制了鮮切生菜褐變的發(fā)生，在第12天才失去食用價(jià)值，因此采用適宜濃度的油菜素內(nèi)酯可以很好地抑制鮮切生菜的褐變，為今后研究鮮切生菜的保鮮和延長(zhǎng)貨架期提供了一種新的嘗試和方向。