羅煒，宋春艷，李彥林，張蔚，魯心怡，曹鈺*

1(江南大學(xué)，教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

鐮刀菌是谷物感染赤霉病的主要病原菌，其在適宜環(huán)境下通過侵染麥子穗部從而導(dǎo)致作物死亡，對農(nóng)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。此外，鐮刀菌還會產(chǎn)生各種真菌毒素，包括玉米赤霉烯酮、伏馬毒素，以及多種單端孢霉烯族毒素等[2]，其中單端孢霉烯B族化合物嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)由于其易溶于水，對各類以谷物為主要原料的食品行業(yè)影響巨大，尤其是在啤酒中的大量堆積，會對人體安全產(chǎn)生重大威脅[3]。

為了保障食品安全性，降低谷物污染程度，可以通過抑制產(chǎn)毒真菌生長來實(shí)現(xiàn)[4]。目前一般采用化學(xué)殺菌劑來達(dá)到抑制產(chǎn)毒真菌生長，減少毒素產(chǎn)生的作用，但化學(xué)試劑可能對人體和環(huán)境產(chǎn)生一定危害[5]，利用生物殺菌劑代替化學(xué)殺菌劑符合人們安全和環(huán)保需求。其中乳酸菌作為生物殺菌劑的典型代表，很早就用于食品防腐殺菌方面，通常乳酸菌都被認(rèn)為是安全的菌株[6]，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，包括有機(jī)酸[7-8]、蛋白類物質(zhì)[9-10]等證明能夠抑制產(chǎn)毒真菌特別是鐮刀菌生長[11]，進(jìn)而降低谷物中DON的產(chǎn)生。研究顯示啤酒生產(chǎn)中DON主要由鐮刀菌在制麥過程中產(chǎn)生，通過在浸麥開始添加乳酸菌菌液，能夠最終降低麥芽中DON質(zhì)量濃度[12]，說明利用乳酸菌降低谷物食品中DON質(zhì)量濃度是可行的。

本實(shí)驗(yàn)通過篩選能夠抑制禾谷鐮刀菌生長的乳酸菌，并研究其對禾谷鐮刀菌DON生物合成的影響，以期為利用乳酸菌降低谷物食品鐮刀菌污染方面提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)ACCC36938，購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基；KMnO4-KBr-MRS培養(yǎng)基[13]：在MRS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度2 g/L KMnO4和質(zhì)量濃度2.5 g/L的KBr；綠豆湯培養(yǎng)基[14]：質(zhì)量濃度30 g/L綠豆加入蒸餾水中煮沸3 min，過濾定容即可。

1.1.3 試劑和儀器

DON試劑盒購自青島普瑞邦生物公司；API50CHL試劑盒購自梅里埃公司；DNA提取試劑盒購自上海生工公司；蛋白酶購自江蘇銳陽公司；其他試劑購自國藥集團(tuán)。

酶標(biāo)儀Enspire2300，珀金埃爾默有限公司；BME顯微鏡，上海徠卡公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌篩選

將土壤、酸菜等發(fā)酵食品樣品加入到滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中于30 ℃下振蕩培養(yǎng)12 h，取其中100 μL液體稀釋凃布到含KMnO4-KBr-MRS培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，選擇透明圈較大的單菌落挑起接種到新的MRS平板上純化2次，然后進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，將革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陰性且能在KMnO4-KBr-MRS平板上產(chǎn)生較大透明圈的菌株初步認(rèn)定為乳酸菌，甘油管保藏。

1.2.2 乳酸菌對禾谷鐮刀菌抑制作用

1.2.2.1 禾谷鐮刀菌孢子制備

將禾谷鐮刀菌接種到PDA培養(yǎng)基上， 25 ℃下培養(yǎng)3 d，然后取部分菌絲接種到綠豆湯培養(yǎng)基中，在200 r/min，25 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)3～5 d至產(chǎn)生大量孢子，血球板計(jì)數(shù)，用無菌水稀釋至105個(gè)孢子/mL濃度，備用。

1.2.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

將篩選得到的乳酸菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下靜置培養(yǎng)24 h，用生理鹽水將其稀釋至濃度為1×109CFU/mL，然后取20 μL乳酸菌菌液點(diǎn)接在MRS平板中心，將其在30 ℃下靜置培養(yǎng)2 d，覆蓋上50 ℃左右每毫升含104個(gè)禾谷鐮刀菌孢子的PDA培養(yǎng)基，凝固后在30 ℃下培養(yǎng)3 d，測量抑菌直徑，以不加乳酸菌的相同濃度的禾谷鐮刀菌孢子培養(yǎng)物做對照。

1.2.3 乳酸菌培養(yǎng)物中抑菌物質(zhì)特性分析

1.2.3.1 乳酸菌上清液的制備

將活化乳酸菌按5%接入MRS培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2 d，10 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，備用。

1.2.3.2 熱處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響

將乳酸菌上清液分別在60、80、100 ℃下處理10 min，然后按1∶9加入到50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，混勻倒平板，待其凝固后在平板中心滴加20 μL禾谷鐮刀菌孢子液，30 ℃培養(yǎng)3 d，測定禾谷鐮刀菌生長直徑，以無菌水代替上清液做對照，計(jì)算各上清液的抑菌率。

抑菌率/%=

1.2.3.3 酶處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響

調(diào)節(jié)乳酸菌上清液的pH值到酸性蛋白酶、中性蛋白酶的胃蛋白酶、胰蛋白酶、過氧化氫酶的最適pH值，按1 mg/mL加入相應(yīng)酶到乳酸菌上清液中，分別在其最適溫度下水浴2 h，處理結(jié)束調(diào)回原pH值，然后按1∶9加入到50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，混勻倒平板，待其凝固后在平板中心滴加20 μL禾谷鐮刀菌孢子液，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察禾谷鐮刀菌生長直徑，以無菌水代替上清液做對照，計(jì)算各上清液的抑菌率(同1.2.3.2)。

1.2.3.4 pH值處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響

采用牛津杯法，將乳酸菌上清液濃縮10倍，分別調(diào)pH值至5.0、6.0，取200 μL禾谷鐮刀菌孢子液涂布到PDA平板上，放置牛津杯，加入200 μL不同pH值的濃縮上清液，以原上清液做對照，30 ℃下培養(yǎng)2 d，記錄抑菌直徑。

1.2.4 乳酸菌在麥芽汁培養(yǎng)基中生長情況

1.2.4.1 麥芽汁培養(yǎng)基制備

按圖1糖化工藝曲線配制麥芽汁培養(yǎng)基，麥芽粉碎度為2，料水比為1∶4，初始按1800 U/g大麥加入中性蛋白酶，糖化結(jié)束后煮沸1 h，濾紙過濾，稀釋成8%糖濃度，加入質(zhì)量濃度10 g/L檸檬酸氫二銨，115 ℃下滅菌20 min。

圖1 麥芽汁制備的糖化工藝曲線Fig.1 Profile of mashing process for wort preparation

1.2.4.2 乳酸菌在麥芽汁培養(yǎng)基中生理特性研究

將活化乳酸菌菌株按10%接種量接入麥芽汁培養(yǎng)基中，在30 ℃下靜置培養(yǎng)，每隔3 h取樣測600 nm下吸光值，以空白培養(yǎng)基做對照，同時(shí)測定樣品總酸，繪制生長曲線和產(chǎn)酸曲線，每組3個(gè)平行。

1.2.5 乳酸菌對禾谷鐮刀菌生長及DON生物合成的影響

將活化乳酸菌接種到麥芽汁培養(yǎng)基中，在30 ℃下培養(yǎng)18 h，然后各取1、5 、10 、20 mL乳酸菌菌液離心菌體細(xì)胞，與4 mL濃度為1×105個(gè)孢子/mL的禾谷鐮刀菌菌液混合倒入滅菌培養(yǎng)皿中，再加入50 ℃左右的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，混合凝固后在25 ℃下培養(yǎng)5 d，以不加乳酸菌菌體的平板做對照，觀察平板禾谷鐮刀菌生長情況。

取平板培養(yǎng)物放入離心管中，搗碎并加入5 mL蒸餾水，按1 g培養(yǎng)物加入到5 mL蒸餾水，在搖床中振蕩混勻3 h，按DON試劑盒測定濾液的毒素質(zhì)量濃度。

1.2.6 乳酸菌上清液對禾谷鐮刀菌生長及DON生物合成的影響

將活化乳酸菌接入到麥芽汁培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)18 h，離心后得到上清液，將其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮16倍，過濾除菌，再分別稀釋至原濃度的8倍、4倍、2倍、1倍濃度，取1 mL各濃度上清液與4 mL濃度為1×105個(gè)孢子/mL的禾谷鐮刀菌菌液混合加入到無菌平板中，再加入50 ℃左右的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，混合凝固后在25 ℃下培養(yǎng)5 d，以不加乳酸菌菌體的平板做對照，觀察平板禾谷鐮刀菌生長情況。

取平板培養(yǎng)物放入離心管中，搗碎并加入5 mL蒸餾水，按1 g培養(yǎng)物加入到5 mL蒸餾水，在搖床中振蕩混勻3 h，按DON試劑盒測定濾液的毒素質(zhì)量濃度。

1.2.7 乳酸菌細(xì)胞對DON吸附作用分析

采用改良的FRANCO方法[15]，將活化乳酸菌接入到麥芽汁培養(yǎng)基中，在30 ℃下培養(yǎng)18 h，各取4 mL菌液，一份煮沸使細(xì)胞失活，另一份做對照，離心后用PBS緩沖液清洗菌體2次，再用無菌水清洗菌體2次，加入配制的DON標(biāo)準(zhǔn)液(1 500 μg/L)，旋渦振蕩后在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，離心測定上清液中毒素質(zhì)量濃度。

1.2.8 乳酸菌鑒定

1.2.8.1 乳酸菌生理生化試驗(yàn)

按照梅里埃碳水化合物鑒定試劑條(API50CHL)的說明書進(jìn)行測試，記錄相關(guān)結(jié)果。

1.2.8.2 乳酸菌分子生物學(xué)鑒定

將菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取乳酸菌DNA，然后利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行序列擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析純化后，送去無錫天霖生物公司測序。將測得序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對，選取同源性較高的模式菌株序列，構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹[16]。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌篩選

從土壤、酸菜等發(fā)酵食品樣品中分離得到革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性，且在KMnO4-KBr-MRS培養(yǎng)基中透明圈大于10 mm的菌株58株，初步認(rèn)定為乳酸菌，編號并甘油管冷凍保藏。

2.2 乳酸菌抑菌實(shí)驗(yàn)

大部分乳酸菌對禾谷鐮刀菌都表現(xiàn)出一定的抑制效果，表1陳列了抑菌直徑大于40 mm的乳酸菌菌株編號，可以看出，A14-2菌株抑制效果最強(qiáng)。

表1 乳酸菌對禾谷鐮刀菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of lactic acid bacteria A14-2 onFusarium graminearum

2.3 乳酸菌培養(yǎng)物的抑菌特性分析

2.3.1 熱處理對乳酸菌上清液抑制活性影響

不同溫度處理上清液，其對抑菌活性影響如圖2所示， 60 ℃水浴處理10 min其抑菌活性相對空白對照組無顯著差異，而80 ℃甚至100 ℃處理上清液，其抑菌活性相對空白對照組下降顯著，降幅達(dá)到26%，說明上清液中存在某種熱不穩(wěn)定性抑菌物質(zhì)，可能是蛋白類物質(zhì)。

圖2 不同處理溫度對乳酸菌上清液抑菌活性影響Fig.2 Effect of heat treatments on the antimicrobial activity of cell-free solution

2.3.2 酶處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響

上清液經(jīng)過蛋白酶、過氧化氫酶處理后，對禾谷鐮刀菌抑制效果的影響結(jié)果如圖3所示，乳酸菌上清液經(jīng)酸性蛋白酶和中性蛋白酶處理，其抑菌率相對空白對照幾乎沒有發(fā)生變化，而經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶處理，其對鐮刀菌抑制率從74.8%分別下降到69.1%和70.5%，變化顯著(p<0.05)，說明上清液中存在某些蛋白類物質(zhì)對鐮刀菌生長具有一定的抑制作用。用過氧化氫酶處理上清液，其抑菌活性變化不明顯，所以可以排除過氧化氫的抑菌作用。

圖3 不同蛋白酶處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響Fig.3 Effect of protease enzyme treatments on the antimi-crobial activity of cell-free solution

2.3.3 pH值處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響

結(jié)果如表2所示，可以看出，將上清液pH值調(diào)至5.0、6.0，其對禾谷鐮刀菌抑制效果消失，說明濃縮乳酸菌上清液的抑菌活性受pH值變化影響較大，可能是有機(jī)酸類物質(zhì)。

表2 pH值處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響Table 2 Effect of pH treatments on the antimicrobial activity of cell-free supernatant

2.4 麥芽汁培養(yǎng)基中乳酸菌生長及產(chǎn)酸

將活化乳酸菌按10%接種量接入麥芽汁培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)18 h，測定其600 nm下吸光度、pH值及總酸，以空白培養(yǎng)基做對照，結(jié)果見圖4。

圖4 乳酸菌A14-2在麥芽汁培養(yǎng)基中生長特性Fig.4 Growth characteristics of Lactobacillus strain A14-2 in wort-based substrate

從結(jié)果可以看出，0～18 h發(fā)酵液pH值逐步降低，OD600值和總酸呈直線上升狀態(tài)，在18 h之后，乳酸菌發(fā)酵液OD值增加變得緩慢，酸度不再增加，pH幾乎不再變化，說明18 h時(shí)乳酸菌生長達(dá)到了穩(wěn)定期。

2.5 乳酸菌抑制禾谷鐮刀菌生長及DON的生物合成

將乳酸菌混合禾谷鐮刀菌，在麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，可以觀察到添加乳酸菌的麥芽汁平板中禾谷鐮刀菌生長都被完全抑制，測定各平板培養(yǎng)物中嘔吐毒素質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖5所示，可以看出，只添加1 mL乳酸菌菌體，DON抑制率就超過了90%，說明乳酸菌在培養(yǎng)基中不僅能夠抑制禾谷鐮刀菌生長，也顯著降低了其DON的產(chǎn)生。

圖5 不同添加量下乳酸菌A14-2對DON生物合成的抑制作用Fig.5 Inhibition of DON production by different amount oflactic acid bacteria

2.6 乳酸菌上清液抑制禾谷鐮刀菌生長及DON的生物合成

各培養(yǎng)基禾谷鐮刀菌生長情況如圖6所示。

a-空白對照；b-添加1倍濃縮上清液；c-添加2倍濃縮上清液；d-添加4倍濃縮上清液；e-添加8倍濃縮上清液；f-添加16倍濃縮上清液圖6 乳酸菌上清液對禾谷鐮刀菌生長抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of lactic acid bacteria supernatant on Fusarium growth

從圖6可以看出，相對空白對照(圖6-a)，1倍(圖6-b)、2倍(圖6-c)濃度乳酸菌上清液對禾谷鐮刀菌生長未顯示出明顯的抑制效果，4倍(圖6-d)、8倍(圖6-e)、16倍(圖6-f)濃度乳酸菌上清液則非常顯著抑制了禾谷鐮刀菌生長，不同濃度乳酸菌上清液對DON產(chǎn)生抑制率測定結(jié)果如圖7所示，DON抑制率隨著乳酸菌上清液濃度的增加變化顯著，雖然圖7中低濃度的乳酸菌上清液對生長的抑制作用不明顯，但對DON生物合成的抑制也已經(jīng)達(dá)到15%～21%，并且上清液濃度越高，其對禾谷鐮刀菌DON的生物合成的抑制作用越強(qiáng)，最大可達(dá)到91%。

圖7 不同濃度乳酸菌上清液對DON生物合成的抑制作用Fig.7 Inhibition of DON production by different concentrations of Lactobacillus supernatant

2.7 乳酸菌菌體細(xì)胞對DON吸附作用

從2.5和2.6結(jié)果可知，禾谷鐮刀菌與1 mL乳酸菌細(xì)胞共同培養(yǎng)不僅生長受到顯著抑制，其DON生物合成量也被抑制了90%，但與對應(yīng)的乳酸菌上清液共同培養(yǎng)時(shí)，生長受抑制作用非常不明顯，其DON生物合成量也僅僅被抑制了15%，2者之間存在差異是否由于乳酸菌細(xì)胞本身吸附毒素的作用而導(dǎo)致的，為此進(jìn)一步進(jìn)行了菌體細(xì)胞對DON吸附作用分析，細(xì)胞分別進(jìn)行非滅活和熱滅活處理后加入到DON溶液中，處理后測定上清液中DON質(zhì)量濃度，結(jié)果如表3所示，從結(jié)果可以看出，無論滅活與否，乳酸菌A14-2細(xì)胞本身并不能夠通過吸附作用降低溶液中DON質(zhì)量濃度。

表3 乳酸菌對DON吸附作用測定結(jié)果Table 3 The determination results of LAB bind of DON

2.8 乳酸菌A14-2菌株的鑒定

2.8.1 乳酸菌生理生化鑒定

梅里埃API50CHL試劑盒測定結(jié)果如表4所示，根據(jù)鑒定結(jié)果分析可以初步確定A14-2菌株為植物乳桿菌。

表4 乳酸菌A14-2菌株的API50CHL生理生化反應(yīng)結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical reaction of A14-2 strain by API50CHL

注：“-”代表陰性；“+”代表陽性。

2.8.2 乳酸菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

將乳酸菌菌株A14-2的PCR產(chǎn)物測序并進(jìn)行同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果如圖8所示，A14-2和植物乳桿菌NBRC 15891親緣性更近，結(jié)合API50CHL碳水化合物利用情況，可以確定A14-2為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

圖8 乳酸菌A14-2的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Polygenetic tree of A14-2 strain based on the complete 16S rDNA sequence

3 討論

本研究從發(fā)酵食品中分離得到1株對禾谷鐮刀菌具有高拮抗活性的乳酸菌株A14-2，經(jīng)生理生化及分子鑒定為植物乳桿菌，對該菌抑菌有效成分分析結(jié)果顯示，其對熱較敏感，對pH值變化異常敏感，但對蛋白酶處理不敏感，說明其抑菌成分主要為有機(jī)酸，也包含一些非蛋白類熱敏感物質(zhì)。通過將不同濃度乳酸菌菌體及發(fā)酵上清液與禾谷鐮刀菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)乳酸菌及其上清液能夠降低禾谷鐮刀菌DON的生物合成，目前很多研究顯示乳酸菌菌體可以通過吸附作用降低溶液中DON質(zhì)量濃度[17-18]，但乳桿菌A14-2并不具備這種作用，其主要作用是通過形成具有抑菌作用的代謝產(chǎn)物以及競爭營養(yǎng)物質(zhì)和形成不利于禾谷鐮刀菌生長的環(huán)境影響鐮刀菌生長和抑制DON的生物合成，但對于已經(jīng)存在的毒素，并不能通過細(xì)胞吸附將其去除。

禾谷鐮刀菌是谷物污染的主要病原菌，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為利用乳酸菌降低谷物食品中嘔吐毒素含量提供了理論依據(jù)，在之后的研究中，可以進(jìn)一步將這株植物乳桿菌應(yīng)用于釀造行業(yè)如麥芽制造過程中，從而探究其實(shí)際應(yīng)用的可行性。